Абай атындағы Қазақ
жүктеу/скачать 5,18 Mb. Pdf көрінісі
|
| Жұмыстың мақсаты: Саңырауқұлақ түрлерінен ДНҚ бөлу əдістерін меңгеру, ДНҚ концентрациясын
анықтау. Міндеттер: 1) Таза екпелерден ДНҚ бөлу əдістерін меңгеру 2)ДНҚ концентрациясын анықтау Теориялық мəліметтер. Дезоксиринбонуклеин қышқылы (ДНҚ) -тірі организмдердің белгілері мен қасиеттері туралы генетикалық ақпараттардың іске асырылуын жəне ұрпақтан ұрпаққа беріліп, сақталуын қамтамасыз ететін нуклеин қышқылдардың екі түрінің бірі болып табылады. Талшықтағы ДНҚ-ның негізгі рөлі РНҚ құрылғысы жəне ақуыздардың құрылымы туралы ақпараттарды ұзақ уақыт сақтау. Химиялық тұрғыдан алғанда ДНҚ – бұл мономер-нуклеотидтерден тұратын полимер. Əрбір нуклеотид азоттық негізден, қанттан (дезоксирибоз) жəне фосфат тобынан тұрады. ДНҚ-да азоттық негіздердің төрт түрі (аденин, гуанин, тимин и цитозин) кездеседі. Нуклеотидтер арасындағы байланыс дезоксирибоз жəне фосфат топтары есебінен түзіледі [26]. Вестник КазНПУ имени Абая, Серия «Педагогические науки», №4 (52), 2016 г. 112 ДНҚ бөліп алу молекула-генетикалық идентификация, молекулалық, генетикалық зерттеулер жүргізу үшін қажет. ДНҚ бөліп алу əдістерінің түрлері көп. Солардың бірі СТАВ əдісін (Gunilla Kärf, 2009)қарастырамыз [27]. Жұмысқа қажетті құралдар мен материалдар: саңырауқұлақ түрлерінің таза екпесі, СТАВ протоколына қажетті реактивтер: 3% CTAB (230ml) – CTAB-6,9 g ddH2O-75 ml, 1M Tris-HCL 35 ml 5M NaCl 120 ml 0,5 M EDTA 920 µl; микроцентрифуга тюбиктері, хлороформ, центрифуга, этил спирті, сыйымдылығы 10-15 мл полипропиленді пробиркалар, 1 мл, 200мкл мөлшерлеуіштерге арналған ұштықтар, су моншасы, спектрофотометр, деиондалған су. 1 - Тапсырма. Alternaria brassicae, Penicillium cyclopium, Fusarium oxysporium түрлерінен ДНҚ бөлу. Ол үшін алдымен СТАВ протоколын егжей-тегжейлі оқып шығып, этаптарын орындау. 1. 1,5 мл микроцентрифуга тюбиктеріне саңырауқұлақ түрінің таза екпесінің жіпшумағын салу қажет (жіпшумақ бөлшегі оңай алыну үшін стерилді сумен аздап араластыруға болады) 2. Үстіне 100 µl СТАВ құйылады. 3. Тюбикте алынған екпе бөлшегі гомогенді күйге енгенше жақсылап бөлшектелу қажет 4. Тюбикке 500 µl 3% CTAB құйылады, жақсылап араласуы үшін Vortex айналмада араласты- рылады 5. 65˚С 1 сағатқа су моншасына қойылады 6. 600 µl хлороформ құйылып, 12 минутқа 13000 rpm айналымға центрифгаланады 7. Беткі бөлігін алып, жаңа 1,5 мл центрифуга тюбиктеріне құйып, үстіне 600 µl хлороформ құйылып, араластырылады 8. Қоспа таза болса, үстіне 1 мл изопропанол (- 20˚С) құйылып, араластырылады. 9. 30 минутқа -18˚С (мұзға) қалдырылады 10. 15 минут 13000 rpm центрифугаланады 11. ДНҚ бөлшегін (пеллет) байқауға болады, сұйықтықты төгіп, тюбиктерді бөлме температура- сында кептіруге қалдырылады. Бөлшекке тиіспеу қажет! 12. Кепкен соң үстіне дистелденген су құйылып, мұздатқышта сақтауға болады. 2 - тапсырма. ДНҚ концентрациясын NanoDrop спектрометрінде өлшеу. ДНҚ бөлініп алынған соң генетикалық-молекулалық зерттеу жұмыстарын жүргізу үшін ДНҚ концентрациясы өлшенеді. ДНҚ концентрациясын NanoDrop 1000 спектрометрінде өлшеу жұмысының протоколы (Protocol for use of NanoDrop® ND-1000 For Nucleic acids) бойынша жүргізіледі. Нуклеин қышқылының сулы ерітіндісін өлшеу үшін 1ul үлгісі дəл жəне қажетті нəтиже алуға жеткілікті. Үлгі өлшемінің дəлдігіне сенімсіз болған жағдайда сұйықтық орналастырылатын орында тамшы пішінді жəне жарық жолы үлгіні түгелдей қаптаған жағдайды мөлшерлеуге болады. NanoDrop 1000 спектрофотометрі максималды концентрациясы 3700 нг/мкл (1А-Сурет). 2.Өлшеу диапазоны 220 - 750 нм. Жұмыс жүргізу бірізділігі: 1. Құрылғы бағдарламалық іске қосылады. (Құрылғыда қосу/ажырату тетігі «on/off» жоқ) Мəліметтерді сақтау үшін «пайдалану/ User» папкасы таңдалады. 2. Сол жақ жоғары экранда көрсетілген «нуклеин қышқылы» жəне қажетті анализ таңдалады. 3. Панел модулдары экранда көрінеді. Осы этапта тумбалар тазартылады жəне сынама су жүктеледі. 4. Барлық көрсеткіштер есебін дайындау үшін «жазба» тетігі басулы болу қажет. 12 немесе 32 рет өлшенгеннен соң есеп дайын болады. 5. «Бос өлшем» орындалған соң, «ДНҚ, РНҚ» немесе басқа анализ таңдалады. Өлшем жүргізіледі, сақталады. Жаңа үлгі жүктеледі. Спектрометрдің жоғарғы жəне төменгі тумбын əр ДНҚ концентра- циясын өлшеу аралығында алдыңғы үлгілердің қалдығы қалмайтындай етіп тазартылып отыру қажет. Өлшеу жұмысы аяқталғаннан соң деиондалған сумен тазартылады. Өлшем циклі 10 секунд шамасында. 6. Арнайы пернелер көмегімен «Баспаға шығару/PrintScreen», «Есепті көру/Show Report», «Сақтау/ Save» сияқты мəліметтерді көруге болады. 7. Барлық мəліметтер автоматты түрде сақталып отырады. Жұмыс соңында «Шығу/ Exit» тетігі арқылы ажыратылады. Құрылғының тазалығын қатаң бақылану қажет. Тазалауға қосымша заттардың қажеті жоқ, қарапайым зертханалық сүрткіш қағаз жеткілікті. |