Общая характеристика методов определения ферментативной активности

Методы определения ферментативной активности:

1. 
   Спектрофотометрические методы. Основаны на поглощении света в определенных участках света функциональными группами, входящими в состав ферментов, субстратов или продуктов реакции. Для измерения спектров используют спектрофотометры, фотометрические абсорбциометры и др. приборы. Этот метод отличается высокой чувствительностью, быстротой определения, малым расходованием ферментов и реактивов и позволяет следить за течением реакции во времени. Для этого реакционную смесь помещают в кювету, вставленную в термостатируемый кюветодержатель. Через малый промежуток времени после добавления фермента и быстрого перемешивания измеряют поглощение при длине волны, характерной для используемого субстрата или конечного продукта.
   
2. 
   Колометрические методы. В основе этих методов лежит измерение при помощи визуального или фотоэлектрического колориметра окрашенного продукта, образующегося при взаимодействии субстрата или продукта действия фермента со специфическими реактивами, которые обычно добавляются в фиксированную опытную форму, взятую после остановки ферментативной реакции.
   
3. 
   Разработаны количественные методы, основанные на биуретовой реакции, при которой состав белка, очевидно, не должен связываться на результатах определения, так как эта реакция на пептидные связи, а не на белковые группы в молекуле белка.
   
4. 
   Метод с отбором проб – наиболее часто используется для определения активности самых разнообразных ферментов. В этом случае из реакционной среды через разные промежутки времени производится отбор проб, в которых содержание продукта реакции определяется после проведения определенных химических его преобразований с получением чаще всего окрашенного продукта реакции.
   
5. 
   Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов с помощью химических реагентов (О-гликозилгидролазы – по образованию восстанавливающих сахаров).
   
6. 
   Манометрический метод – определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (оксидазы – по поглощению О₂, декарбоксилазы – по выделению СО₂).
   
7. 
   Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения (β-фруктофуранозидаза).
   
8. 
   Хроматографический – количественное определение субстрата или продуктов с помощью различных видов хроматографии: бумажной (анализ сахаров), тонкослойной (гликозидов со сложными агликонами), ВЭЖХ (аминокислотный анализ и др.).