Биотехнология
жүктеу/скачать 11,01 Mb. Pdf көрінісі
|
| §
-с Е а Ь и I о 3 § с о Е “і 5 л -с ■§ § р V I 0 1 § § и 2 а я І = 5* и а о еі ? 5 2 £ ч* О І І З і ' І - 1 1 қз з £ ■« » і €і-1- 3*2 ^ я ь -2 І І І 3 : 1 1 * §•§ 98 VI. БИОЛОГИЯЛЫ Қ НЫСАНДАР - ПРОДУЦЕНТТЕРДІҢ СЕЛЕКЦИЯСЫ Биологиялық нысанды іске қосу мен жетілдіру бірдей әдістемелік ұстанымға сүиенеді - дәстүрлі немесе дәстүрлі емес биотехнологияда қолданылатын жануар организмі, өсімдік немесе микроорганизмдер культурасына қарамастан, жасуша генотипіне озгерістер енгізу болады. Биотехнология тарихында биологиялық нысандармен жү- мыс қолда барды жетілдірумен басталган (тағы - мәдени өсімдіктер, тағы - ауыл шаруашылықты жануарлар, топырақ- тық микроорганизмдер - антибиотиктердің, витаминдердің продуценттері, т.б.). Қазіргі уақытта биотехнологияда түр- лендірілген микроорганизмдерді, трансгендік жануарлар мен өсімдіктерді жасау маңызды, яғни жаңа бионысандар. Биологиялық нысандардың жасушаларындағы генетика- лық өзгерістер өздігінен, индукңиялық генезді болуы мүмкін немесе жасуша-реңипиентке белгілі қасиеттерімен нақты генді (гендерді) рекомбинанттық ДНК технологиясы жолы- мен кіргізу нәтижесінде пайда болуы тиіс. Мүндайда генети- калық озгерістер түр ішілік, түр аралық сипатта болуы мүм- кін, оған қоса эукариоттық жасушаның гендерін прокариот геномына енгізуге немесе керісінше болады. Жалпы алғанда дәстүрлі селекңияда да, рекомбинанттық ДНК технология- сында да табиғатта бар немесе синтезделген генетикалық материалды организмдер арасында қайта алмастыру жөнінде сөз болады. 1. Өндірістік микроорганизмдер селекциясы Селекция - бүл ДНК-ның нуклеотидтік ретін өзгерту нәти- жесінде күшейген немесе пайда болған пайдалы биологиялық қасиеттері жағынан басқалардан озық штамдарды микро- организмдер популяциялар арасынан сүрыптау (18-сурет). Пайдалы қасиеттері бар микроорганизмдермен саналы жүмыс жасау, өндірістік микроорганизмдер селекциясы жануарлардың ауыл шаруашылық түқымдары, мәдени және 99 Селекция нысанын таңдау тұқым қуалаушылық өзгергіш і Мутагенез Рекомбиногенез Өзіндік немесе физикалық, Будандастыру, жасушаны химиялық, биологиялық біріктіру, гендік инженерия, әсерлермен индукциялық; белгілі коньюгация, трансформация, класты мутантгарды алу әдістері трансдукция I Сүрыптау Т абиғи немесе жасанды Селекция нәтижесінде алынған штамдардын қасиетін тұрақгандыру Әртүрлі тәсілдермен консервациялау 18-сурет. Микроорганизмдердщ селекциялау үлпсі. сәндік өсімдіктер селекциясьша қарағанда мыңжылдық тарихы жоқ. Микроорганизмдер өзі онша ерте ашылып, зерттелген емес. Селекция - бүл үздіксіз іздену, штамм-продуценттерді фенотиптік көрінісі бойьшша оларды интуитивтік сүрыптау- дан ДНК молекулаларын қүрастыру жолы, түрленген микро- организмдерді жасау (рекомбинанттық ДНК технологнясы). Селекция - бүл микроорганизмдердің белгілі түріне тән пайдалы метаболиттердің өнімін арттырудан (ферменттер, антибиотиктер, аминқышқылдары, т.б.) микроорганизмге тән емес биологиялық белсенді заттарды зерттеушінің багдарла- малы синтезіне дейінгі (рекомбинанттық ДНК технологиясы) жолы. Мысалы, Е. со//-инсулин, интерферон, т.б. продуценті. Селекцияны әртүрлі табиғи көздерден бөлінген микро- организмдер штамдары, өндірістік штамдары, коллекциялы культуралар арасында жүргізеді. Микроорганизмдердің жылдам өсуі мен көбеюіне қара- мастан, популяцңяда өзіндік мутациялар әжептәуір сирек кездеседі: азоттық, негіздердің жүптары (гуанин-цитозин, 00 аденин-тимин) жүз миллион репликацияда бір рет өзгеріске ұшырайды. Индукциялайтын мутагенез әжептәуір күшті, мутациялар жиілігі өзіндік мутациялармен салыстырғанда 2-4 реттік деңгейде өседі. Бастапқы ДНК азоттың негіздерімен өзара әсері мен немесе ДНК репликациясына әсер етуімен өзгерістер енгізуге қабі- летгі және индукцияланган мутагенез тудыратын мутагендік себепкер шарттар есебінде қолданылады (19-кесте): • УФО, рентген, гамма-сәулелер, нейтрондар, т.б. • Химиялық қосылыстар: этиленимин, азоттық иприт, 5-бромурацил| 2-аминопурин, т.б. • Бактериофагтар - биологиялық мутагендік себепті шарт- тар есебінде. Селекциялық үдерісте бір немесе бірнеше мутагендер әсері кезінде уақыт бойынша сатылы, біртіндеп, кезеңді сүрыптау басым. Мысалы, пенициллин продуценті Репісііііит сһгу50§е- пит селекциялық жүмыста бірнеше ондаган жыл бойы өнім- дік белсенділігін он мың есе артыққа көтерді; ашытқы жасу- шалары Егетоіһесіит азһЪуі рибофлавин өнімін екі мың есе арттыр ды. Селекциялык әдістерді табысты қолдану Зігеріотусез туыс- тастыгынан бастапқы культураға карағанда антибиотиктерді бірнеше ондаған рет артық өндіретін микроорганизмдер штамын көбейтіп, аса жоғары продуценттерді жылдам алуға мүмкіндік берді. Тек пенициллин синтезін зерттегенде, анти- биотиктердің продуценттер селекциясының үдерісі өнді- рістік бағалы микроорганизмдердің осы күнгі селекциялық технологиясының негізін қалады. Селекцияда тек бір мутагендік себепкер шарттар қолда- нумен қатар бірнеше мутагендерді пайдалануға мүмкіндік бар. Мысалы, стрептомицин продуценты - Зігеріотусев §гі- зеиз антибиотикті 250 ед/мл мөлшерде синтездейді. УФ-сәуле әсерімен 2000 ед/мл өндіретін мутант селекцияланды, штамды этилениминмен кейін мутациялағанда өнім 3000 ед/мл тең. Ал химиялық және физикалық мутагенмен бірге әсер еткенде 101 0 к1 оч X 3 >4 а . 3 ео О X л к 5 5Г \С >> я 5 3 а сз к 5 л Н а> 4 а г ғп 5 X л (■I а о о а 8 Л а л н Б О н а а> Ч я и сз н >> £ 9В 3 н л 3 X л 4 о □ ш н к к 1 1 и М іл т Ы о Рн 4) 3 н 3 сі ю сй * 3 >5 св X а. < • рвв« & & > 5 & сх «і 5 « 5 О Ом <□ аэ й 5 ач Р. св Ң ң О Ч О і рц 5Г л о ж ез & а. сй & Ц в 5 м X оз &. Р-і еи л сх еб 5 о х X со Е я О- Н і р ф X X о ? £Х I 2 а. «я и. О * я? 3 е£ О. св « К ЙГ оЗ н >» 2 Р * > \ I а . ’р 3 Ьй ’5 І • и и 1 1 I 1 св 33 1 І | н о о. сЗ 1 В <о ЕІ <и е* &. св 5 2 ЕГ 5 со й а О- Н -а а . ев и. о * і Ос 0 а о х оз &. н о . со е; « 5 X сб О- а . сз о? М о і Й « X св а. н н о н к 5 * и X о £ а . 09 5 N 5 3 з со К 1 сЗ X 0 1 ъ а . 5Г о Ф сч о 03 ю • шшя/ >> В ’оо >* а, (Й 5 о о о о а X і СЗ оо 5 а о 5 а о е* X X ч X 2 X а, х С <й X 3 о « х сЗ Щ х а> а >> х о X X сЗ 00 о щ X X со о X о 03 X о 2 А 0 ^ § в. 1 щ а © 1 I й ы і 5 I I X X ш т >> X о § X X п § оз н \£ 3 а зХ сз ис 3 е; ос X іг са X о X о си «=1 а о е=1 2 о X X 0 1 & 2 «3 | 5 о о с; >* Ф о X а> н к о си а св д х 0 1 5Х 0 X 0 1 I § ? л А I I и х х X 1 X 03 >» н о т О э- X Я 102 103 Зігеріотусез ^гізёщ өндіруші қабілеті 15-20 мың ед/мл дейін көтерілді. Мутанттарды сатылы сұрыптау органикалық қышқылдар продуценттерін селекциялауда орын алады. Мыс., мұражай- лық культура А$рег§і11ш пщег кезеңнен кезеңге этиленимин, УФ-сәулелер, нитрозометилмочевина және гамма-сәулелер әсеріне ұшырады, ақырында штамнан өте жоғары продуцент алынды. Ферменттер синтезін көтеру кұрделі, өйткені олар ақуыздар, жасуша ішінде бірнеше механизмдер мен олардың метаболизмі реттеледі. Дегенмен, жекеленген мутагенез арқа- сында бастапқы мұражайлық культураларға қарағанда мақ- сатты ферменттерді көп артық синтездейтін Азрег§і11ш цщег (а-амилаза) мен Азрег§і11и$ ам>атогі (глюкоамилаза) штам- дары алынды. Селекңиялаиган мутанттардың оте жогары өндіруилілік белсенділігі келесі механизмдермен байланысты: • қажетгі метаболиттерді синтездеуге қатысушы фермент- тердің белсенділігін жоғарылату; • қажетті метаболит бойынша депрессия кұйі (аллостерлік реттеуді басу) немесе кері байланыс типі бойынша тежеуді тоқтату; ; 3 ~ і • аса жоғары өндірілетін метаболит ұшін көтеріңкі жасу- шалық және цитоплазмалық өткізгіштік; • жасушада метаболизмдік үдерістердің реттеу механизм- дерін өзгерту (фосфорлық метаболизм, тыныс алу жүйесі, т.б.). Өндірістік микроорганизмдерді прототрофтар арасынан емес, көбінесе ауксотрофтық мутанттардан селекциялайды. Жасушада синтезделетін метаболиттердің концентрациясы кері байланыс типі бойынша реттеледі - негативтік бақылау деп аталады: жасуша ішінде қажетті метаболит жиналған саиын, солғұрлым жасуша ішінде баяулатқыш механизмдер- дщ әсері күшті ошінеді немесе аталмыш метаоолиттщ синтезі толық басылады. Егер де жасуша-мутант алынған метаболит бойынша депрессия күйінде болса, онда тіпті көптеген есе оның қажетінен асса да, оның синтезі тежелмейді (тоқтал- майды), ягни аса' жоғары өнімдік орын алады. 104 Депрессияның мәні кері байланыс типі бойынша био- синтезге қатысатын ферменттердің белсенділігінің басылу механизмі істен шығады (аллостерлік реттеу), фермент син- тезі және әрине, қажетті метаболиттің түзелуі жалғаса береді. Жасуша қабырғасы, ңитоплазматикалық мембрананың өткізгіштігінің арнайы арттыруы есебінен жасушадан мета- болитті тездетіп шығарып алу аталмыш метаболизмдік бел- сенділікті қолдауға мүмкіндік береді. Айырмашылығы жоғары организмдерден белгілі артық- шьшықтарына қарамастан микроорганизмдердің селекңиясы (үрпақтардың тез ауысуы, микроорганизмдердің керекті клонын бөлудің күрделі еместігі, көп жағдайларда геномның гаплоидтыгынан білінбейтін өзгерістің жоқтығы) мутанттың арнайы белсенділігін сақтау мәселесі әжептәуір күрделі. Өндірістік штамның биоөндіргіш белсенділігін түрақты қол- дау үшін синтезінің арнайьшығымен, қоректік ортада жоғары өнімділігімен, тозімділігімен ерекшеленетін микроорганизм- дерді популяңиядан үнемі клондау, сүрыптауға тура келеді. Өндірістік микроорганизмдердің өндіргіштік қасиеттерін жақсартуға әкелетін мутациялардың әртүрлі варианттары бар. Жануарлар рационында ауыстырылмайтын аминқыш- қылы лизиннің синтезі мысалында аталмыш метаболитгің оте жоғары өніміне қол жеткізу үшін, мутациялардың әртүрлі варианттары келтірілген. СогупеЪасІегіит §1иіатісит қорек- тік ортадағы көмірсулардың үштен бір бөлігінен артығын лизинге түрлендіреді, 1 л қоректік ортадан 70 г лизин шыға- рады. Лизин микроб жасушасындағы зат алмасу жолдарында біреуінің ақырғы метаболиті болады, ол жол үш аминқыш- қылдары - лизин, метионин, треонин - үшін бір жол Бакте- риалык жасушада бүл аминқьппқылдардьщ синтезі кері байла- ныс типі бойынша реттеледі. Екі аминқышқылдарының — треонин және лизиннің қүнарлығы микроорганизм қажетінен асқанда, онда биосинтезге қатысушы фермент аспартаткина- заның баяулануы болады. Жасушада треонин мен лизиннің артық молшерде жиналуы аспартаткиназаны баяулатады, ал 105 бұл екі аминқышқылдарының жеткіліксіздігі ферментті бел- сендендіреді, оның синтезінің жылдамдығын үдетеді. Лизин жоғары синтезі екі типті мутанттар селекңиясы арқасында іске асты. Бірінші типті мутантта гомосериндегид- рогеназа синтезіне жауап беретін геннің мутациясы салдары- нан, бұл ферменттің белсенділігі жоғалады, нәтижесінде мутантгық жасушада метионин мен аспартаткиназаның баяу- лауының бірі треониннің синтезі тоқтапады. Мутантты микро- организм қоректік ортаға метионин мен треонинді кіргізсе ғана өсе алады. Микробтық жасушалар өсуі мен көбеюі ұшін бұл аминқышқылдарды төменгі мөлшерде қоректік ортаға треонин төменгі мөлшерде аспартаткиназаның треонин ауксотрофты Лизин артық мөлшерде өндіріле бастайды, ал треонин қоректік ортада төменгі мөлшерде болатындықтан, екі амин- қьшіқылы бірігіп, аспартаткиназаның активтілігін төмендет- пеиді. Екінші типті мутантта аспартаткиназаның өзінің синтезіне жауап беретін геннің мутациясы орын алады. Нәтижесінде лизин құнарлығының өзгерісіне сезімталдығын көрсетпеиді, сондықтан кері байланыс типі бойынша баяулату болмайды. Мутациялармен қатар өте жоғары продуценттерді селек- циялауда рекомбинациялар технологиясы - микроорганизм- дер арасында гендер орын ауыстыруын қолданады. Жақын емес микроорганизмдер арасында, яғни әртүрлі микроорга- низмдер арасында гендерді тасымалдағанда көбінесе прото- пластылар пайдаланылады. Генетикалық материалдарды тасы- малдау көбінесе плазмидалар мен бактериофагтар көмегімен іске асырылады. Мысалы, рекомбинация тәсілдерінің бірін - гибридизацияны этанол өндірісінде пайдаланатын ашытқы жасушасын 8ассһаготусез сегеуш ае селекциялауда қолда- нады. Бұл ашытқы жасушаларында ашытқы субстраты - сірнеде болатын көмірсу раффинозаны ыдырататын фермент меллибиаза жоқ. Бұл көмірсуды Засскагот усез сегечт ае қорыту үшін, микроорганизмдерді раффинозаны ашытатын 106 сыра ашытқы жасушаларымен 8ассһаготусез сагХвЪещёпш түрімен гнбрндтеді (будандастырылды). Селекциялаиған мутант-гибрид екі аналық микроорганизмдер қасиеттеріне ие болды, яғни сірнені толық қорытты. Гибридтер селекциясында басқа да амалдар мүмкін, мыса- лы, сахароза мен мальтозаны ашытатын сыра ашытқы жасу- шалары Зассһаготусез сагһЪещетіз штамын бүл көмірсу- ларды қорыта алмайтын Зассһаготусез £ІоЪо$из ашытқы жасушалары культурасымен гибридтеген. Селекция нәтиже- сінде тек мальтозаны сіңіретін мутант алынды. Бүл гибрид "бархыттық сыра" (қүрамында ашымаған сахароза бар) деген атпен өндірісте пайдаланылады. Сонымен, әртүрлі әдістерді қолданып, микроорганизм- дердің өндірістік бағалы штамдары селекцияланады, штам- дардың алынған қасиеттері түрақтанады; штамм-продуцент- тер әртүрлі тәсілдермен консервацияланады. 2. Өсімдік ш аруаш ылығындағы селекция Тағы өсімдіктерді мәдениеттендіру, оларды күнделікті шаруашылықта қолдану көне замандардан белгілі. Ауыл- шаруашылық өсімдіктерін егіннің шығымдылығы бойынша, түқымдардың сапасы және басқа қасиеттері бойынша сүрып- тау тәжірибеге сәйкес іске асты. Осындайда өсімдіктердің жергілікті сүрыптары, сүрыптық түқымдастыру пайда болды, өсімдіктердің көшеттігі қалыптасты. Одан кейін жаңа сүрып- тарды жергілікті сүрыптармен будандастыруға негізделген селекция меңгерілді, нәтижесінде жоғары тамақтың сипат- тамасымен және оған қоса жергілікті ауа-райы климаттық жағдайларға бейімделген өсімдіктер алынды (бидай, тары, жүгері, т.б.). Жаңа сүрыптарды басқа аймақтарға әкелу (интро- дукция, іпігосіисііоп — кірістіру) өсімдік шаруашылығында кең пайдаланылады. Әрине, селекциялық жүмыстың нөтиже- лері агротехнологияны сақтағанда ғана табысты жүзеге асып жүрді. Селекция табыстылыгы бастапқы материалдың генетика- лық әртүрлігіне байланысты екені белгілі. Мысалға, дүние- 107 жүзінде бидайдың мың үлгілері, картоптың 200 ден аса түр- лері бар деп есептеледі. Өсімдіктердің генотипінің ең елеулі өзгерісі түр аралық немесе туыс аралық будандасуда орын алады, яғни алыстық гибридизацияда. Бірақ, табиғи жағ- дайлардағы будандасудың механизмдері мәні бойынша түр ішілік будандасу (өздігінен тозандану және аналық аузы айқас тозаңдауы, қалемшелеу, телінуші, т.б) жолдары, алыстық гибридизацияларда нәтиже бермейді. Бүл әдістемелік қиындықтарды мутагендік, күйзелістік (абиотикалық, биотикалық) себепкер шарттар әсері жағ- дайында жасушалардың суспензиялық культурасын, прото- пластыларды немесе тіндік культураны (көбінесе каллустық тінді) пайдаланып, іп \ііго жағдайында жасушалық селек- цияны жеңуге мүмкіндік береді. Селекциялық тәжірибеде селекцияның өзінің алдын ала- тын қосымша технологиялар, генетикалық озгергішке, бас- тапқы материалдың клональдық әртүрлігіне әкеліп соғатын генетикалық әртүрлігін жасайтын технологияларды жиі қолданады. Қосымша технологияларга жатады: • Будандастырылатын дақылдардың прогамдық (1) және постгамдық (2) сыйымсыздықты жеңуі. 1. Іп уііго жагдайында үрықтандыру (ш уііго жағдайында тозаңды және үрықтанбаған түқым бүрін өсіру). Табиғи жағ- дайларда аналық аузында тозаңның өсуге қабілетсіздігі, тозаңның түқым бүруіне жету мүмкіндігі жоқтығынан бүл болмайды. 2. Жетілмеген гибридтық түқым бүрі мен үрықтардың культурасы (эмбриокультура). Бүл технология түр аралық пен туыс аралық үрықтардың тіршілікке қабілетін сақтауға мүмкіндік береді, яғни алыстан гибридизация жолымен алынған эмбриондар. Бөлінген үрықтарды і п у і і г о жағдайында өсіру, өсімдікті алуға мүмкіндік береді. Табиғи жағдайда мүндай үрық әдетте өспейді. Селекциялық үдерісті гаплоидтарды жасап, пайдалану секілді қосымша технологияны да пайдаланумен үдетуге 108 болады. Тіндер культураларынан гаплоидтарды апудың бір- неше өдістері бар; — андрогенез немесе бөлінген шаңжнғыш және микроспо- ралардан жасанды қоректік ортада гаплоидгық өсімдіктерді алу; — гиногенез немесе бөлінген тұқым бүрінен жасанды қоректік ортада гаплоидтық өсімдіктерді алу; — партеногенез немесе гибридтік үрықтан гаплоидтарды алу, онда ата-аналық хромосомалардың сыйымсыздығынан аталық хромосомалар жоғалған. Гаплоидтық өсімдіктердің артықшылықтары мынада: — хромосомалардың бір жинағы диплоидтық өсімдіктерге карағанда мутацияны оңай анықтауға мүмкіндік береді, онда геннің рецессивті жағдайында мутациялар фенотипті көрініс бермейді; — гаплоидтық жасушалардан хромосомалардың екі есе- ленген мөлшерімен гомозиготтық өсімдікті алу. Регенерант- тарды колхицинмен қосымша өңдегеннен кейін толық гомо- зиготты дигаплоидтық өсімдіктер пайда болады. Микроорганизмдер секілді өсімдік жасушаларының селек- циясы мутациялар мен рекомбинацияларға негізделген. Алдыңғылары күйзелістік себепкер шарттар (биотикалық және абиотикалық) әсерінен пайда болады, кейінгісі - гене- тикалық ақпараттармен түр аралық және туыс аралық алмасу нәтижес і. Тура селекцияны айырады, мұнда өсіру күйзелістік селек- тивтік себепкер шарттар (антибиотик, фитопатоген токсині, тұздьщ жоғары қүнарлығы, т.б.) бар қоректік ортада жүргізі- леді, кейін бүның қорытындысы бойынша төзімді клондарды сұрыптайды. Бұл өсімдіктердің сұрыптары немесе линия- ларының күйзелістік себеп шарттарға төзімділерін селекция- лардың ең кең таралған технологиясы (19-сурет). Тура емес немесе негативті селекция - азоттық негіздің аналогы (мысалы, тимидин) бар ортада өсіргенде, бастапқы жасушалар көбейеді, ал мутацияланғандар көбеймейді. Бас- тапқы жасушалар (өсімдіктің тағы түрі) көбейгенде тимидин- нің аналогы репликациялайтын ДНК-ға кіреді, бұл үдерісті 109 |