Репликация днк: учебное пособие
жүктеу/скачать 2,57 Mb. Pdf көрінісі
|
разделяются, и последующие превращения происходят уже с однонитевой ДНК. RРА стаби- лизирует однонитевую ДНК, нарушая ее вторичную структуру. Рис. 13. Строение белка SSB E.coli Основные ДНК-связывающие домены RPA (А, В и С) входят в состав р70 субъеди- ницы. При связывании однонитевой ДНК RРА претерпевает значительные конформацион- ные перестройки, модулируемые длиной выступающего участка матричной цепи. Недавно была выяснена роль р32 субъединицы RPA в связывании RРА с ДНК. В случае ДНК-дуплек- сов с выступающим участком матрицы размером 30 и 18 н наблюдали преимущественное ковалентное присоединение р32-субъединицы к 3'-концу праймера, в то время как укороче- ние матричной цепи до 13–12 н. и далее обеспечивало в основном ковалентное присоеди- И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие» 44 нение субъединицы р70. р32 субъединица RРА размещается вблизи 3'-конца праймера при протяженном матричном участке и удаляется из области контакта с З'-концом праймера при укорочении матрицы. С помощью электронной микроскопии показано, что RРА в комплексе с однонитевой ДНК принимает в зависимости от длины участка ДНК элонгированную, сжа- тую или глобулярную конформации. Это показано на рис. 14. И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие» 45 Рис. 14.Конформационные изменения RPA Предполагалось, что в этих конформациях изменяется расположение субъединиц RРА относительно 3'-конца растущей цепи. В вытянутой конформации RРА субъединица р32 рас- положена вблизи З'-конца растущей цепи ДНК, в то время как изменение конформации RРА к сжатой и далее к глобулярной форме удаляет р32 от ее 3'-конца. Изменение конформаиии RРА зависит исключительно от длины выступающего участка матрицы. В районах однонитевых брешей однонитевая ДНК связывается с А и В ДНК-связыва- ющими доменами субъединицы р70, при этом 5'-конец ДНК взаимодействует с доменом А, в то время как домен В расположен ближе к 3'-концу, что говорит о преимущественном вза- имодействии р70 с 3'-концом бреши (рис. 14). Предложена модель, позволяющая рассмотреть возможное расположение RРА в бре- шах. В случае небольшой бреши размером 9-10 н RРА связывается с ее однонитевым участ- ком, используя свои основные ДНК-связывающие домены А и В субъединицы р70. При этом RРА находится в глобулярной конформации, в которой субъединица р32 практически не кон- тактирует с 3'-концом праймера. В протяженной бреши RРА принимает вытянутую конфор- мацию, в которой контакты р32 с 3'-концом праймера облегчены, но в то же время всегда доминирует взаимодействие субъединицы р70 с однонитевой платформой бреши, в особен- ности на ее 5'-конце. Связь р14 субъединицы с ДНК в составе полной молекулы. RPA не была обнаружена. Возможно, что эта субъединица закрыта от контактов с ДНК двумя другими субъединицами RРА. По-видимому, субъединица р14 выполняет структурно (как шарнир между субъедини- цами р70 и р32) организует гетеротример RРА, однако ее точная роль в структуре RРА оста- ется неясной. Таким образом, взаимодействие RРА с ДНК может быть рассмотрено как многоста- дийный процесс, в ходе которого RPA взаимодействует с участком 8-10 н, и это связыва- ние осуществляется с помощью ДНК-связывающих доменов А и В субъединицы р70. Такое взаимодействие RРА осуществляет, по-видимому, находясь в глобулярной форме. При нали- чии более протяженного участка однонитевой структуры ДНК RРА изменяет свою конфор- мацию, что делает возможным взаимодействие с ДНК другого домена субъединицы р70 – домена С, а затем и ДНК-связывающего домена D субъединицы р32. Такой тип связывания RРА может быть осуществлен в его «вытянутой» конформации в том случае, когда участок однонитевой ДНК достигает размера около 30 н. RРА в таком комплексе проявляет свое мак- симальное сродство к однонитевой ДНК. Возможно, что такое расположение ДНК-связыва- ющих доменов обеспечивает возможность более легкого «вытеснения» RРА при заполнении однонитевых брешей в ходе синтеза ДНК ДНК-полимеразами. Белок RРА (в нефосфорилированной форме) стимулирует полимеразную активность и увеличивает процессивность ДНК-полимеразы α. Фосфорилирование RРА, а также мутации в N-концевой области субъединицы р32 предотвращают взаимодействие белков и активацию ДНК-полимеразы α. В ходе клеточного цикла уровень фосфорилирования RРА меняется и носит регулятор- ный характер. Участки фосфорилирования RРА находятся в N-концевом фрагменте субъеди- ницы 32 кДа. При повреждающих воздействиях на клетку, типа УФ-облучения, происходит гиперфосфорилирование RРА, коррелирующее с подавлением репликации ДНК. жүктеу/скачать 2,57 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|