С курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров
жүктеу/скачать 2,61 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Определение титра антител
Часть 2. Частные вопросы биотехнологии. Клеточная биотехнология 124 Метод С. Определение антител у морских свинок. Готовят не менее трех разведений с 2,5–5-кратным шагом. Каждой свинке вводят подкожно 1,0 мл разведения, предназначенного для данной группы животных. Через 35–42 дня после иммунизации подходящим методом берут образцы крови у каждого вакцинированного и контрольного животного. Подходящим иммунохимическим методом определяют содержание антител. Определение титра антител Приведенные ниже твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА ELISA)) и Vero-Tecт являются примером иммунохимических методов, признанных подходящими для определения титра антител. Определение титра антител в сыворотке морской свинки с помощью тИФА. Лунки используют для исследуемых сывороток, отрицательного и положительного контролей. Покрывают лунки планшета для тИФА 100 мкл раствора дифтерийноro анатоксина. Планшет оставляют на ночь при температуре 4ºС во влажной камере. На следующий день пластины тщательно отмывают промывочным буферным раствором. Готовят подходящие разведения отрицательной и положительной контрольных сывороток и испытуемых сывороток. Инкубируют при температуре 37ºС в течение 2 ч. Oтмывают промывочным буферным раствором. Готовят подходящее разведение конъюгата пероксидазы в блокирующем буферном растворе и прибавляют по 100 мкл в каждую лунку. Инкубируют при температуре 37ºС во влажной камере в течение 1 ч. Отмывают планшет промывочным буферным раствором. Прибавляют по 100 мкл субстратногo раствора в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Учитывают реакцию при длине волны 405 нм. Определение титра антител в сыворотке морской свинки с помощью Vero-теста. Метод основан на регистрации угнетения метаболизма (1) или цитотоксичности (2) в качестве конечногo эффекта. Регистрация может быть выполнена путем микроскопии клеток (определение клеточной морфологии) или макроскопически (по изменению цвета). Конечная точка метода может быть определена как максимальное разведение сыворотки, которое защищает клетки от дифтерийногo токсина. Активность антитоксина рассчитывается по сравнению с референтной сывороткой морской свинки или стандартным образцом ВОЗ и выражается в МЕ/мл. Метод 1. Дифтерийный токсин оказывает цитопатическое действие (ЦПД) на клетки Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) и их |