Витальное и суправитальное окрашивание

Исследования живых клеток и тканей в культуре (in vitro). 
Этот метод яв­
ляется одним из самых распространенных. Выделенные из организма чело­
века или животных клетки, маленькие образцы тканей или органов поме­
щают в стеклянные или пластмассовые сосуды, содержащие специальную 
питательную среду — плазму крови, эмбриональный экстракт, а также ис­
кусственные среды. Различают суспензионные культуры (клетки взвешены 
в среде), тканевые, органные и монослойные культуры (клетки образуют 
при росте и культивировании на стекле сплошной слой). Обеспечиваются 
стерильность среды и температура, соответствующая температуре тела. В 
этих условиях клетки в течение длительного времени сохраняют основные 
показатели жизнедеятельности — способность к росту, размножению, диф- 
ференцировке, движению. Такие культуры могут существовать многие дни, 
месяцы и даже годы, если обновлять среду культивирования и пересаживать 
жизнеспособные клетки в другие сосуды. Некоторые виды клеток благодаря 
изменениям в их геноме могут сохраняться и размножаться в культуре, об­
разуя непрерывные клеточные линии. В настоящее время получены клеточ­
ные линии фибробластов, миоцитов, эпителиоцитов, макрофагов и др., ко­
торые существуют многие годы.
Использование метода культивирования позволило выявить ряд законо­
мерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, кле­
точных взаимодействий, взаимодействий клеток с вирусами и микробами. 
Показана возможность хрящевых клеток формировать в культуре межкле­
точное вещество и способность клеток надпочечников продуцировать гор­
моны. Культивирование эмбриональных тканей и органов дало возмож­
ность проследить развитие кости, кожи и других органов. Разработана мето­
дика культивирования нервных клеток.
Особую значимость метод культуры тканей имеет для проведения экспе­
риментальных наблюдений на клетках и тканях человека. Взятые из орга­
низма человека клетки при пункции или биопсии могут в культуре тканей 
использоваться для определения пола, наследственных заболеваний, злока­
чественного перерождения, выявления действия ряда токсичных веществ.
Разработаны методы разделения тканей на клетки, выделения отдельных 
типов клеток и их культивирования.
Вначале ткань превращают в суспензию клеток путем разрушения межклеточных 
контактов и межклеточного матрикса с помощью протеолитических ферментов 
(трипсин, коллагеназа) и соединений, связывающих Са2+ (с помощью ЭДТА — эти- 
лендиаминотетрауксусной кислоты). Далее полученную суспензию разделяют на 
фракции клеток различных типов с помощью центрифугирования, позволяющего 
отделить более тяжелые клетки от легких, большие от малых, или путем прилипания 
клеток к стеклу или пластмассе, способность к которому у различных типов клеток 
неодинакова. Для обеспечения специфического прилипания клеток к поверхности 
стекла используют антитела, специфически связывающиеся с клетками одного типа. 
Прилипшие клетки затем отделяют, разрушая матрикс ферментами, при этом полу­
чают взвесь однородных клеток. Более тонким методом разделения клеток является 
мечение антителами, связанными с флюоресцирующими красителями. Меченые 
клетки отделяются от немеченых с помощью сортера (электронного флюоресцентно- 
активируемого клеточного анализатора). Клеточный анализатор сортирует в 1 с око­
ло 5000 клеток. Выделенные клетки можно изучать в условиях культивирования.
Метод культивирования клеток позволяет изучать их жизнедеятельность, размно­
жение, дифференцировку, взаимодействие с другими клетками, влияние гормонов, 
факторов роста и др.
19

Культуры обычно готовят из суспензии клеток, полученной вышеописанным ме­
тодом диссоциации ткани. Большинство клеток неспособны расти в суспензии, им 
необходима твердая поверхность, в качестве которой используют поверхность пла­
стиковой культуральной чашки, иногда с компонентами внеклеточного матрикса, 
например коллагена. 
Первичными культурами
называют культуры, приготовленные 
непосредственно после первого этапа фракционирования клеток, 
вторичными —
культуры клеток, пересаженные из первичных культур в новую среду. Можно после­
довательно перевивать клетки в течение недель и месяцев, при этом клетки сохраня­
ют характерные для них признаки дифференцировки (например, клетки эпителия 
образуют слои). Исходным материалом для клеточных культур обычно служат эм­
бриональные ткани и ткани новорожденных.
В качестве питательных сред используют смеси солей, аминокислот, витаминов, 
лошадиной сыворотки, экстракт куриных эмбрионов, эмбриональную сыворотку 
и др. В настоящее время разработаны специальные среды для культивирования раз­
личных типов клеток. Они содержат один или несколько белковых факторов роста, 
необходимых клеткам для жизнедеятельности и размножения. Например, для роста 
нервных клеток необходим фактор роста нервов (ФРН).
У большинства клеток в культуре наблюдается определенное число делений (50— 
100), а затем они погибают. Иногда в культуре появляются мутантные клетки, кото­
рые размножаются бесконечно и образуют клеточную линию (фибробласты, эпите- 
лиоциты, миобласты и др.). Мутантные клетки отличаются от раковых клеток, также 
способных к непрерывному делению, но могущих расти без прикрепления к твердой 
поверхности. Раковые клетки в культуральных чашках образуют более плотную по­
пуляцию, чем популяции обычных клеток. Аналогичное свойство можно вызвать 
экспериментально у нормальных клеток путем трансформации их опухолеродными 
вирусами или химическими соединениями, при этом образуются неопластически 
трансформированные клеточные линии. Клеточные линии ^трансформированных 
и трансформированных клеток можно длительно сохранять при низких температурах 
(-70 °С). Генетическую однородность клеток усиливают клонированием, когда из 
одной клетки при ее последовательном делении получают большую колонию одно­
родных клеток. Клон — это популяция клеток, происходящих из одной клетки- 
предшественника. В последние годы клеточные культуры широко применяются для 
г и б р и д и з а ц и и к л е т о к .

жүктеу/скачать 31,79 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: