Полимеразды тізбекті реакция əдісінің негіздері

59
сонымен қатар денсаулық сақтау саласында зертханалық диагности-
ка жүргізуде, санитарлық-эпидемиологиялық жəне ветеринарлық 
қадағалау жүйесінде (генотиптеу, жұқпалы аурулардың диагности-
касы, генетикалық модификациялық ағзаларды анықтау, ет түрлерін 
жəне ет өнімдерінің ингредиенттерін жəне басқаларды идентифика-
циялау) кеңінен қолданылады.
Зертханалық диагностика құралы ретінде ПТР əдісінің негізінде 
ізделіп отырған фрагменттің жинақталуына арналған полимеразды 
тізбекті реакцияны қолдана отырып, анықталатын ағзаға тəн ДНҚ-
ның кішкентай фрагментін анықтауда жатыр.
ПТР əдісін қолдану арқылы анализді жүргізу əдістемесі:
1) сынама материалынан ДНҚ- ын бөліп алу;
2) ДНҚ-ның спецификалық фрагменттерін амплификациялау;
3) амплификация өнімдерін детектирлеу сияқты үш кезеңнен 
тұрады.
ДНҚ-ын бөліп алу. Талдау жүргізудің бұл кезеңінде зерттелетін 
үлгі арнайы өңдеуге ұшырайды, нəтижесінде:
– жасушалы материалдың лизисі;
– полимеразды тізбекті реакцияны тежейтін заттардан тазарту 
(полисахаридтер, липидтер, май қышқылдары, белоктар жəне т.б.);
– ПТР ингибиторларынан босаған, кейінгі амплификацияға дайын 
ДНҚ-ның таза препаратын бөліп алу сияқты жұмыстар жүргізіледі.
ДНҚ-ның спецификалық фрагменттерін амплификациялау. 
Бұл кезеңде кейінгі анықталуына қажетті мөлшерде ДНҚ-ның қысқа 
спецификалық фрагменттерінің жинақталуы жүреді.
Амплификация негізінде ДНҚ-ның ферменті полимеразаның 
көмегімен катализделетін, ДНҚ-ның спецификалық бөлімдерінің 
көшірме сандарын бірнеше рет ұлғайтудың табиғи процесі жатыр. 
ДНҚ матрицасының комплементарлы құрылысын бітіру процесі, со-
нымен қатар ДНҚ репликациясы деп аталады.
ДНҚ амплификациясы:
– ДНҚ денатурациясы (қос спиральды тарқату, ДНҚ жіптерінің 
айырылысы);
– ДНҚ-ның қысқа екітізбекті бөлімдерінің түзілуі (ДНҚ синтезін 
инициациялауға қажетті «күйдіргіш»);
– ДНҚ жаңа тізбегінің синтезі (екі жіптің комплементарлы 
құрылысын бітіру) сияқты бірнеше кезеңнен тұрады.
Бұл процесті нақты ағзаларға тəн, ДНҚ-ның қысқа бөлімдерінің 
көшірмесін алуға қолдануға болады.

60
Термотұрақты ДНҚ-полимеразаның (Taq-полимеразалар) 
ашылуы ДНҚ-ның репликация процесін циклді етіп, оны in vitro 
жұмысына қолдануға мүмкіндік берді. Синтез циклдері бірнеше рет 
қайталанғанда ДНҚ-ның спецификалық фрагменті көшірмесінің 
сандары экспоненциалды түрде ұлғаяды, бұл анықталатын 
ағзалардың жеке жасушаларынан тұруы мүмкін талданатын 
материалдың азғантай мөлшерінен, əртүрлі əдістермен (электрофо-
рез, иммуноферменттік анализ (ИФА) жəне т.б.) идентификациялау 
үшін ДНҚ-көшірмелерінің жеткілікті мөлшерін алуға мүмкіндік 
береді.
Тізбектің комплементарлы құрылысын бітіру ДНҚ кезектілігінің 
кез келген нүктесінде басталмайды, тек белгілі бастапқы блоктар-
да – қысқа екі жіпті бөлімдерде басталады. Осындай блоктарды 
ДНҚ-ның спецификалық бөлімдеріне біріктіргенде жаңа тізбектің 
синтез процесін ДНҚ- тізбегінің барлық ұзындығына емес, тек осы 
бөліміне бағыттауға болады.
ДНҚ-ның берілген бөлімдерінде бастапқы блоктарды құру 
үшін праймерлер деп аталатын екі олигонуклеотидті «күйдіргіш 
(шүрпілерді)» қолданады, олар спецификалық фрагмент шекарасын-
да ДНҚ кезектілігіне комплементарлы болып келеді жəне ДНҚ-ның 
жаңа тізбектерінің құрылысын тек праймерлер арасында аяқтауға 
бағытталған.

жүктеу/скачать 1,24 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: