Репликация днк: учебное пособие

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
40
ется фактором димеризации репликативных холоферментов, подобно субъединице τ в ДНК-
полимеразе III Е. соli. В отсутствие РСNА ДНК-полимераза δ имеет низкую процессив-
ность на длинных однонитевых матрицах, а в присутствии РСNA процессивность возрас-
тает в 10-100 раз. С помощью делеционных мутантов установлено, что в ДНК-полимеразе δ
мыши за связывание РСNА ответствен участок 129–149 аминокислотных остатков N-конце-
вой области каталитического полипептида, С-концевой домен менее консервативен и содер-
жит два участка связывания ДНК.
Холофермент ДНК-полимеразы δ включает в себя фактор процессивности РСNА и
факторы RFС (replication factor C) и RРА, он собирается на праймер-матричном комплексе
в следующем порядке: сначала RFС связывается с 3'-ОН-концом праймера на однонитевой
ДНК-матрице, "покрытой" белком RРА. Затем RFС в присутствии АТР формирует на ДНК-
дуплексе, прилежащем к 3'-концу праймера, кольцевую структуру из трех молекул РСNА
с мол массой 36 кДа каждая, а РCNA обеспечивает присоединение ДНК-полимеразы δ к
3'-концу праймера, завершая таким образом формирование высокопроцессивного холофер-
мента.
B самом РСNА идентифицированы участки, отвечающие за связывание с субъедини-
цами RFС и ДНК-полимеразами. В присоединении к ДНК у полимеразы δ участвуют ами-
нокислотные остатки 121–135, образующие петлю между доменами РСNА.
3'→5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы δ также регулируется факторами,
входящими в состав холофермента. В отсутствие вспомогательных факторов 3'→5'-экзо-
нуклеазная активность ДНК-полимеразы δ низка, но в присутствии белка RРА, как и ДНК-
полимеразы α, она возрастает в 8-10 раз. Активирующий эффект RРА на 3'→5'-экзонуклеаз-
ную активность обусловлен, очевидно, дестабилизацией комплекса затравки с матрицей в
присутствии этого белкового комплекса.
Синтез ДНК-полимеразы δ в клеточном цикле регулируется на уровне транскрипции.
Количество мРНК фермента и белка достигает максимума на границе G1/S-фаз. Динамика
синтеза ДНК-полимеразы δ в цикле соответствует динамике ДНК-полимеразы α. Интересно,
что синтез РСNА в ходе клеточного цикла коррелирует с синтезом ДНК-полимеразы δ,
однако содержание РСNА стабильно увеличивается и остается высоким до границы фаз G2/
М. ДНК-полимераза δ представляет собой фосфобелок, наибольшая степень фосфорилиро-
вания которого относится к фазе S. Фосфорилирование каталитической субъединицы 125
кДа ДНК-полимеразы δ осуществляется, очевидно, специфичной для фазы G1 циклин-зави-
симой протеинкиназой сdk2. Интересно, что фосфорилирование каталитической субъеди-
ницы не сказывается на ее ферментативной активности.
ДНК-полимераза ε человека содержит два полипептида – каталитический 261 кДа и
55 кДа. ДНК-полимераза ε дрожжей состоит из пяти субъединиц: каталитической 256 кДа
и субъединиц 80, 34, 31 и 29 кДа. Субъединица 80 кДа ДНК-полимеразы ε дрожжей явля-
ется гомологом субъединицы 55 кДа фермента из клеток млекопитающих. Ферментатив-
ные активности – ДНК-полимеразная и 3'→5'-экзонуклеазная – связаны с высокомолекуляр-
ным полипептидом, N-концевой домен которого обеспечивает обе активности, а С-концевой
домен необходим для контроля вступления клетки в S-фазу цикла.
Особенностью холофермента ДНК-полимеразы ε является его меньшая зависимость
от вспомогательных факторов РСNА, RFС и RРА по сравнению с холоферментом ДНК-
полимеразы δ. ДНК-полимераза ε способна процессивно удлинять затравку на одноните-
вых матрицах в отсутствие РСNА. В присутствии полного набора репликативных факто-
ров увеличивается процессивность синтеза и эффективность связывания ДНК-полимеразы
ε с праймерами. Существует представление, что на ДНК-матрицах, покрытых белком RРА,
факторы РСNА, RFС и АТР образуют «комплекс узнавания 3'-ОН-конца праймера». Участок
связывания ДНК-полимеразы ε в молекуле РСNА не совпадает с участком связывания ДНК-

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
41
полимеразы δ. Об этом свидетельствует тот факт, что разные мутантные формы белка PCNA,
синтезируемые штаммами рспа-79 и рспа-90, не способны взаимодействовать с ДНК-поли-
меразами δ и ε соответственно. В результате у мутанта рспа-79 нарушен синтез ДНК, ката-
лизируемый ДНК-полимеразой δ, а у мутанта рспа-90 – ДНК-полимеразой ε.
Другое различие между холоферментами ДНК-полимераз δ и ε заключается в разной
скорости синтеза ДНК. В оптимальных условиях скорость синтеза ДНК холоферментом
ДНК-полимеразы ε примерно на порядок ниже скорости синтеза холоферментом ДНК-поли-
меразы δ. Это различие связано с разной функцией ДНК-полимераз в репликативной вилке.
Один холофермент ДНК-полимеразы δ осуществляет быстрый и процессивный синтез лиди-
рующей нити, используя для элонгации единственный праймеру, синтезируемый в районе
ori, и диссоциирует только по достижении конца репликона, а несколько холоферментов
ДНК-полимеразы ε могут одновременно синтезировать фрагменты Оказаки в «зоне Ока-
заки», удлиняя праймеры, синтезируемые ДНК-полимеразой α-праймазой в начале каждого
фрагмента. При этом должен происходить быстрый оборот ДНК-полимеразы ε, сопровож-
дающийся диссоциацией после завершения синтеза фрагмента и ассоциацией с праймером
очередного фрагмента. При синтезе фрагментов запаздывающей цепи, когда концентрация
праймеров высока и могут синтезироваться одновременно несколько фрагментов, скорость
полимеризации менеее важна, чем спосбность к быстрому переключению с одного фраг-
мента Оказаки к другому.
Содержание мРНК ДНК-полимеразы ε в клеточном цикле изменяется, достигая своего
максимума непосредственно перед клеточным делением. Уровень этой мРНК в пролифери-
рующих клетках в 5-16 раз выше, чем в покоящихся.
ДНК-полимеразы, δ и ε, обладают 3'→5'-экзонуклеазной активностью, выполняющей
корректорскую функцию в ходе синтеза ДНК, но частоты ошибок при синтезе лидирующей
и запаздывающей нитей отличаются. Это связано с тем, что часть ДНК отстающей нити
синтезируется ДНК-полимеразой α, которая способна синтезировать ДНК с большим коли-
чеством ошибок.

жүктеу/скачать 2,57 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: