Репликация днк: учебное пособие

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
96
метилазы, была клонирована в 1988 г. Это белок, состоящий из 1620 аминокислотных
остатков с молекулярной массой 190 кДа, проявляющий оптимальную метилтрансферазную
активность на полуметилированной ДНК. Размер этого фермента по сравнению с прока-
риотическими ферментами значительно увеличен, что обусловлено наличием на N-конце-
вой части Dnmt1 регуляторного домена, составляющего две трети всей молекулы. В клетке
ДНК-метилаза Dnmt1 выполняет функцию поддерживающего метилирования ДНК, спе-
цифичность которой контролирует N-концевой домен. N-концевой домен ДНК-метилазы
Dnmt1 позволяет ферменту различать в ДНК неметилированные и полуметилированные
СрG-последовательности и предпочтительно метилировать in vitro и in vivo эти полумети-
лированные сайты. Лишенный своего N-концевого домена, фермент теряет это свойство и
превращается в обычную прокариотическую ДНК-метилазу. Однако недавно это положение
пересмотрено и показано, что существенная часть N-концевого домена без первых 300 ами-
нокислот требуется также и для энзиматической активности метилазы Dnmt1. Предполага-
ется, что N-концевой домен нужен для правильного формирования третичной структуры
метилазы Dnmt1. кДНК гена Dnmt1 человека клонирована и охарактеризована. Структура
этой метилазы, включая N-концевой домен, близка к структуре соответствующей метилазы
мыши.
По-видимому, ген DNMT1 возник путем слияния гена прокариотической ДНК-мети-
лазы с одним или двумя генами, кодирующими ДНК-связывающиеся белки.
ДНК-метилаза Dnmt1 ассоциирована с областью репликации ДНК в течение S-фазы
и распределена диффузно в нуклеоплазме в клетках, находящихся вне S-фазы. Метилаза
Dnmt1 человека и животных является компонентом репликативного комплекса. На это ука-
зывает, в частности, способность фермента связываться с ядерным антигеном пролифери-
руюших клеток человека. N-концевой регуляторный и С-концевой каталитический домены
молекулы Dnmt1 связаны GК-аминокисдотными повторами. Следует отметить, что ДНК-
метилаза Dnmt1 содержит в своем N-кониевом домене аминокислотные последовательно-
сти, гомологичные транскрипционному репрессору НRХ, посредством которого фермент
ассоциирован in vivo с гистоновыми деацетилазами. Список некоторых белков, способных
ассоциировать с эукариотическими ДНК-метилазами, представлен в табл. 3.
Рис. 35. Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз семейства Dnmt1.
Хотя Dnmt1 предпочтительно работает на полуметилированных сайтах, этот фермент
способен также метилировать необычные субстраты с различными структурными аномали-
ями. Мышиная ДНК-метилаза способна метилировать также и однонитевую ДНК, если она
содержит в своей цепи m
5
С. Предполагается, что фермент распознает присутствующий в
однонитевой цепи ДНК m
5
С в качестве сигнала для метилирования немодифицированных
остатков цитозина в последовательностях СрG и работает на петлевых участках одноните-
вой цепи. Аналогичной способностью модифицировать однонитевые ДНК обладает ДНК-
метилаза Е. соli dam, участвующая в процессах репликации и репарации ДНК. Сайт m
5
С

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
97
может также служить сигналом для Dnmt1 на полуметилированной и полностью неметили-
рованной последовательностях СрG в двунитевых субстратах, причем скорость метилиро-
вания de novo таких полуметилированных субстратов в несколько раз выше скорости мети-
лирования немодифицированных субстратов.
Dnmt1 человека может избирательно узнавать и метилировать полуметилированные
асимметричные двунитевые ДНК, несущие «целевую мишень» СрG на одной цепи и спа-
ренный с ней метилированный цитидиновый остаток в комплементарной цепи. Интересно,
что соседство этого метилированного цитидина в своей цепи с гуанозином не обязательно:
соседом может быть любой нуклеозид или его производное. На рис. 35 показано, как полу-
метилированная дуплексная последовательность детерминирует метилирование цитозина
(*С) в СрG-последовательности нижней цепи. Видно, что С не обязательно должен быть
спарен с G верхней цепи. Асимметричный сайт узнавания заключен в рамку.
Оптимальные для метилирования de novo субстраты содержат между немодифици-
рованными динуклеотидами СрG другие последовательности длиной 13-17нуклеотидов.
Важно также отметить метилирование de novo мышиной ДНК-метилазой остатков цито-
зина в последовательностях, отличающихся от СрG, и более выраженное проявление этой
способности на однонитевой ДНК. Вероятно, наблюдаемый в клетках различных эукариот
несимметричный тип метилирования в ДНК остатков цитозина может осуществляться ДНК-
метилазами при участии специальных регуляторных факторов, модулирующих специфич-
ность узнавания метилируемой последовательности.
Инактивация гена мышиной метилазы Dnmt1 приводит к значительному (до 70 %) сни-
жению общего уровня метилирования генома и к гибели развивающихся эмбрионов. Данные
о сохранении 30 %-ного уровня метилирования ДНК и способности эмбриональных ство-
ловых клеток, лишенных метилазы Dnmt1, метилировать ретровирусную ДНК de novo ука-
зывали на выполнение этих функций другими ДНК-метилазами. Поиск таких ДНК-метилаз
у животных выявил новые ферменты семейств Dnmt2 и DnmtЗ.

жүктеу/скачать 2,57 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: