Учебное пособие Красноярск сфу 2019 (07) ббк
жүктеу/скачать 7,51 Mb. Pdf көрінісі
|
| 7.2. NO-синтаза
7.2.1. Строение и механизм действия NO-синтазы Молекула NO-синтазы (NOS) состоит из двух идентичных субъединиц, то есть является гомодимером. В каждой субъеди- нице различают два домена — оксигеназный (окислительный) на N-конце и редуктазный (восстановительный) на С-конце. В качестве мостика между доменами выступает кальмодулин- связывающий участок. N-концевой домен оксигеназы содержит сайты связывания аргинина (субстрат-связывающий центр), гема (осуществляет перенос электронов) и тетрагидробиоптерина (H 4 B) — кофермента, который, по-видимому, участвует в пере- носе отщепляемой от аргинина группы. С-терминальный редук- тазный домен содержит три функциональных центра: никотина- мидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН), флавинадениндину- клеотид (ФАД), флавинмононуклеотид (ФМН). Фермент активен только после димеризации субъединиц, которая инициируется связыванием одной молекулы кальмодулина с каждым мономе- ром (рис. 40). 84 Димер фермента стабилизируется ионом цинка, который тетраэдрически окружен четырьмя остатками цистеина. В ре- зультате формируется так называемый цинк-тиолатный кластер, в образовании которого участвует мотив Cys- Х–Х-Х–Х-Cys каж- дого из мономеров NO-синтазы. Стоит отметить, что ион цинка в данном случае играет структурную, а не каталитическую роль (Chreifi et al., 2014; Hemmens et al., 2000; Li et al., 1999). Оксигеназный домен по структуре и функции напоминает цитохром Р450, а редуктазный — цитохром Р450-редуктазу (она также содержит ФАД, ФМН и передает электроны от НАДФН на гем цитихрома Р450). В случае же NO-синтазы в структуре и функционировании фермента есть и свои особенности: NOS имеет дополнительный функциональный центр, с которым свя- зывается H 4 B; фермент содержит кальмодулин и, следовательно, активируется ионами Са 2+ ; в отсутствие ионов Са 2+ NO-синтаза (кроме одной из ее изоформ) не содержит кальмодулин и практи- чески неактивна. Редуктазный домен осуществляет перенос электронов от НАДФН на ФАД, далее на ФМН в оксигеназном домене, ко- торый катализирует основную реакцию. На первой стадии про- исходит гидроксилирование аргинина с образованием гидрок- сиаргинина, окисляющегося на следующей стадии до оксоарги- нина. При расщеплении последнего происходит освобождение NO и образование промежуточного карбодиимида, который Рис. 40. Строение гомодимераNO-синтазы 85 гидролизуется до цитруллина (Stuehr et al., 2001). На 1 моль обра- зовавшегося NO расходуется 2 моль О 2 и 1,5 моль восстановлен- ного НАДФH (рис. 41). Таким образом, суммарная реакция образования NO выгля- дит следующим образом: Существенное значение для реализации этого процесса име- ет связывание с оксигеназным доменом тетрагидробиоптерина. Как установлено при детальном изучении кристаллов фермента, H 4 B необходим для сближения кислорода, связанного с желе- зом гема, с гуанидиновой группой аргинина. Белок кальмодулин необходим для проявления ферментом каталитической активно- сти (Alderton et al., 2001; Forsterman et al., 2012). 7.2.2. Изоформы NO-cинтазы NO-синтаза присутствует не во всех клетках. Известны три изоформы NOS: эндотелиальная, нейрональная и макро- фагальная. Рис. 41. Образование оксида азота в результате окисления аргинина NO-синтазой 86 Две изоформы фермента конститутивны, то есть постоян- но присутствуют в эндотелии сосудов (еNOS) и нервной системе (nNOS). Их клеточная активность регулируется внутриклеточ- ной концентрацией кальция. Третья изоформа — индуцибельная (iNOS); она появляется при воспалительных, иммунных и не- которых других реакциях в макрофагах, а по некоторым дан- ным — и в ряде прочих клеток (например в гепатоцитах). iNOS менее зависима от концентрации ионов Ca 2+ в клетке. Если свя- зывание кальмодулина с конститутивными изоформами и, соот- ветственно, их активация происходят лишь при повышении кон- центрации ионов Ca 2+ , то индуцибельная изоформа связывается с кальмодулином и при фоновой концентрации ионов Ca 2+ (ме- нее 40 нМ). Это происходит благодаря высокому сродству iNOS к кальмодулину (Cho et al., 1992; Hemmens et al., 2000). Нейрональная NO-синтаза. Каждый мономер фермента со- держит N-концевой домен PDZ, который отвечает за связывание с мембранными гликопротеиновыми комплексами, что необхо- димо для синаптической компартментализации фермента в ней- ронах и его ассоциации с сарколеммой в скелетных и сердечной мышцах. Функции нейронального NO чрезвычайно разнообраз- ны: он контролирует осцилляторную активность нейронов, явля- ется медиатором ноцицепции, термогенеза, обоняния, принятия пищи и воды, снижает тревожность, регулирует выход нейроме- диаторов, участвует в процессах координации и баланса, играет значительную роль в процессах обучения и памяти. NO, проду- цируемый в мозге, — это один из важнейших рычагов, с помо- щью которых нервная система управляет тонусом сосудов, снаб- жающих кровью все системы организма (Izumi et al., 1993; Тoda et al., 2009; Zhou et al., 2009). Эндотелиальная NO-синтаза. Каждая субъединица фермен- та содержит М-концевой участок присоединения гидрофобного остатка миристиновой кислоты, с помощью которого происходит прикрепление фермента к внутренней поверхности плазматиче- ской мембраны эндотелиальных клеток. NO, образованный eNOS, участвует в регуляции тонуса кровеносных и лимфатических со- судов, а также в предупреждении тромбообразования (Fleming et al., 2010; Rudic et al., 1998; Walter et al., 2009). Индуцибельная NO-синтаза. Для iNOS характерна делеция аминокислотной последовательности, примыкающей к центру связывания кальмодулина. Выпадение этой последовательности |