Высшее образование
Факторы, влияющие на клональное микроразмножение
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
19b6c9a
| Факторы, влияющие на клональное микроразмножение. Питательная среда. Состав питательной среды — один из наиболее важных факторов при микроразмножении. Обычно используют стандартные среды: Мурасиге-Скуга, Нича и др., но с добавлением на каждом этапе различных веществ. На первом этапе в питательную среду часто вносят антиоксиданты, чтобы предотвратить гибель клеток из-за активизации гидролитических ферментов. Особое значение имеют концентрация и соотношение фитогормонов в среде. Например, на втором этапе для усиления морфогенеза обычно добавляют цитокинины. Напротив, на третьем этапе при укоренении в питательной среде должно быть только небольшое количество ауксинов (либо используется безгормональная среда). Иногда в среду добавляют гиббереллин (ГК), который стимулирует рост сформировавшихся почек. Важным регуляторным фактором служит сахароза. Обычная концентрация ее в среде составляет 3 %. На растениях каперса было показано, что более высокая концентрация сахарозы в среде приводила к образованию пурпурных, содержащих антоциан, почек возобновления. При концентрациях сахарозы менее 3 % наблюдалось формирование зеленых почек, способных к размножению.
Кроме того, существенное значение имеет состояние среды. Например, культивирование меристем земляники, вишни, черной смородины лучше происходит в жидкой питательной среде, чем в агаризованной. Состояние экспланта. Морфогенез в значительной мере определяется возрастом и размером экспланта. Так, у эхеверии эксплантат из молодых листьев образуют корни, из старых листьев — побеги. И только у листьев среднего возраста возникают и побеги, и корни, т.е. появляется возможность регенерации целого растения. Размер экспланта прямо пропорционально связан с регенера- ционной способностью: чем крупнее эксплант, тем выше эта способность. Большие экспланты могут самопроизвольно независимо от соотношения в питательной среде ауксинов и цитокининов образовывать почки. Но увеличение размера может привести к негативным последствиям, так как появляется вероятность присутствия в экспланте клеток, содержащих вирусную, грибковую и другие виды инфекции. Оптимальная величина экспланта должна обеспечивать как активный морфогенез, так и полную стерильность. На регенерационную способность экспланта влияют также физиологическое состояние и таксономическая принадлежность растения-донора. Например, экспланты, выделенные из растений в фазу покоя, обладают более низкой способностью к укоренению и развитию побегов по сравнению с эксплантами, изолированными в фазу активного роста. Двудольные травянистые растения характеризуются большей регенерационной способностью, чем однодольные. Чем больше размер экспланта, тем легче идет морфогенез, в результате которого получается целое растение, но тем больше вероятность присутствия вирусов в экспланте. У многих видов и сортов растений зона, свободная от вирусных частиц, различна. Так, при клонировании апикальной меристемы картофеля размером 0,2 мм (конус нарастания с одним листовым зачатком) 70 % полученных растений были свободны от Y-вируса картофеля, но только 10 % — от Х-вируса. В некоторых случаях не удается найти оптимальное соотношение между размером меристематического экспланта и морфогенезом в нем, и при этом избавиться от вирусной инфекции. Приходится дополнять метод культуры меристем термо- или(и) хемитерапией. Так, предварительная термотерапия исходных растений позволяет получать свободные от вирусов растения-регенеранты из меристемных эксплантов размером от 0,3 мм до 0,8 мм. Вместе с тем этот прием может вызвать отставание растений в росте, деформацию органов, увеличение латентных (скрытых) инфекций. Хорошие результаты дает совместное применение метода культуры тканей и хемитерапии. При внесении в питательную среду препарата «Вирозол» (1-рибофуранозил-1,2,4-триазолкарбоксамид) количество безвирусных растений увеличивается до 80 — 100%. В настоящее время для диагностики вирусных растений используют иммуноферментную технику, моноклональные антитела, метод молекулярной гибридизации меченых фрагментов РНК- и ДНК-вироидов и вирусов с вирусами тестируемого объекта. Эти методы очень чувствительны, но трудоемки и дорогостоящи. После оздоровления с помощью вышеперечисленных технологий нормальные растения-регенеранты размножают обычными методами клонального микроразмножения. Для некоторых растений, например цитрусовых, получить морфогенез из меристем малого размера не удается, поэтому требуется разработка оригинальных методов. Лимоны и апельсины оздоровляют и размножают, используя прививки меристем размером 0,14 — 0,18 мм на пробирочные подвои, полученные из семян. Достоинство такого подхода состоит и в том, что развивающиеся из меристем побеги не имеют ювенильных признаков, при этом цветение и плодоношение ускоряются. 6.8.4. Криосохранение Сохранение разнообразия форм жизни — важнейшая проблема, с которой столкнулось современное человечество. Еще Г. Ф. Гаузе доказал, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Следовательно, сохранение биоразнообразия — единственный механизм стабильности жизни на Земле.Кроме того, для обеспечения питанием растущего населения нашей планеты необходимо выведение новых, более продуктивных сортов сельскохозяйственных растений, а для успешной селекции важен постоянный приток генов из новых источников. Традиционным источником генетического материала служат дикие виды растений. Однако в связи с расширением городов, сельскохозяйственных угодий, вырубкой лесов, ухудшением экологии эти виды постепенно вытесняются, а многие из них находятся на грани вымирания, поэтому их необходимо сохранить. Существует несколько способов сохранения генофонда высших растений: заповедники, национальные парки, банки семян. В последнее время большое внимание уделяется созданию и развитию новых способов: пересадочных коллекций каллусных клеток, депонированию культур клеток и, наконец, криосохранению, т. е. хранению объектов при очень низкой температуре, обычно это температура жидкого азота (-196 °С). Криосохранение имеет существенные преимущества по сравнению с остальными методами. При сохранении в глубоко замороженном состоянии полностью прекращается обмен веществ, отсутствуют значительные физико- химические молекулярные изменения не только в клетке, но и в окружающей водной среде. Сохраняется генофонд, а следовательно, все свойства замороженного объекта. Единственный негативный фактор, которого не удается избежать, — это фоновая ионизирующая радиация. Однако, по мнению М.Ашвуд-Смита, потребуется примерно 32 000 лет для накопления 10% летальных хромосомных повреждений. Следовательно, криогенный метод дает возможность неограниченно долго хранить растительный материал без существенных изменений: сохраняются жизнеспособность клеток, их свойства, а также способность к морфогенезу и регенерации целых растений. Сущность метода криосохранения сводится к замораживанию специально подготовленных растительных клеток при использовании криопротекторов — веществ, ослабляющих повреждения клеток при замораживании и оттаивании. В настоящее время известны * два метода криосохранения: программное (медленное) и сверхбыстрое замораживание. Программное замораживание изучалось уже : давно, поэтому оно довольно широко применяется для сохранения животных и растительных клеток. Разработка сверхбыстрого замо-^ раживания началась сравнительно недавно, однако считается, что | именно этот метод со временем станет наиболее перспективным. | Трудности криосохранения растений связаны со спецификой 1 растительных клеток. Клетки растений имеют большие размеры! (в культуре тканей они изменяются от 15 до 1000 мкм), прочную! целлюлозную стенку и вакуоли. Причем именно степень вакуоли-! зации играет основную роль в устойчивости клеток к действию! низких температур. В зрелой клетке центральная вакуоль занимает! до 90 % общего объема клетки, т. е. клетка представляет собой как бы резервуар с водой, которая необходима для ее нормальной жизнедеятельности. Поэтому основные факторы, способные привести клетку к гибели при замораживании, — это образование льда и дегидратация. Обычно кристаллы льда сначала образуются во внешнем растворе вокруг клеток. Максимальная скорость их роста в зависимости от состава раствора находится в пределах температур от -20 до -60 "С. При температуре -140 °С рост кристаллов льда совершенно прекращается. Следовательно, и при замораживании, и при оттаивании клеткам очень важно с оптимальной скоростью «проскочить» температуру образования льда. Кристаллы внеклеточного льда могут механически разрушать клетки. Кроме того, они играют водоотнимающую роль, что приводит к значительной дегидратации клетки и возможной ее гибели от осмотического стресса. При очень быстром замораживании лед может образовываться и внутри клеток, что ведет к разрушению в ней многочисленных мембран. Избежать кристаллизации льда помогла бы витрификация воды, т. е. затвердение ее в аморфном состоянии. Получить витрифика- цию чистой воды практически невозможно. Но в коллоидных растворах скорость образования центров кристаллизации и роста кристаллов льда снижается и повышается температура, при которой их рост прекращается. Все это облегчает витрификацию. Добавление криопротекторов также затрудняет кристаллизацию льда и способствует витрификации. Наиболее известны такие криопротекторы, как диметилсуль- фоксид (ДМСО), различные сахара, глицерин, этиленгликоль и их производные. Действие криопротекторов состоит в снижении количества свободной воды, повышении вязкости раствора. Все криопротекторы делят на две группы: проникающие и непроникающие. Это разделение достаточно условно. Так, глицерин — первое вещество, определенное как криопротектор, может проникать в клетку, если его добавлять при комнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение, если его добавлять при температуре 0 °С. Принято считать, что непроникающие криопротекторы специфически влияют на мембрану, повышая ее проницаемость. Применение сильных, проникающих в клетку криопротекторов ограничено их токсичностью. Поэтому обычно используют смеси криопротекторов, так как в них токсичность одного из веществ снижается за счет присутствия другого. Жизнеспособность клеток после замораживания зависит не только от предупреждения образования льда, но и от их состояния. Крупные вакуолизированные клетки погибают гораздо чаще, чем мелкие меристемоидные. Поэтому на этапе подготовки культуры к замораживанию ее культивируют в условиях, способствующих образованию мелких клеток и синхронизации их деления.Кроме того, концентрирование клеток в культуре, т.е. увеличение ее плотности, способствует повышению выживаемости клеток после замораживания. Таким образом, криосохранение достаточно надежно обеспечивает сохранение генофонда. Перспективность этого метода подтверждается возобновлением после хранения в жидком азоте суспензионных культур моркови, явора, кукурузы, риса, сахарного тростника; каллусных — тополя, маршанции, сахарного тростника; андрогенных эмбриоидов — беладонны, табака и др. Из восстановленных после замораживания культур моркови и табака удалось регенерировать целые растения. После быстрого замораживания сохранили жизнеспособность меристемы земляники, малины, гвоздики, томатов, картофеля и ряда других растений. Однако для криосохранения требуется сложная работа по подбору условий, обеспечивающих выживание клеток и, следовательно, возможность последующей регенерации из них целых растений. Необходимо учитывать генетические и морфофизиологичес- кие особенности клеток, способность к закаливанию, уровень проницаемости клеточных мембран, подбор криопротекторов, скорость снижения температуры при замораживании, условия оттаивания.ЗАКЛЮЧЕНИЕ Круг вопросов, к решению которых привлекают биотехнологические методы и достижения, достаточно широк. Большинство из них прямо или косвенно связано с глобальными проблемами, стоящими перед современной цивилизацией, такими, как загрязнение окружающей среды, угроза экологического кризиса, истощение запасов полезных ископаемых, опасность мирового энергетического кризиса, нехватка продовольствия, борьба с болезнями. Благодаря достижениям фундаментальных исследований в молекулярной биологии, биохимии, генетической инженерии и новейшим технологиям в биоиндустрии получают новые продукты заданного состава и качества, очищенные от экотоксикантов и обладающие не только питательной ценностью, но и профилактическими свойствами. Таким путем получена серия продуктов на основе сои, созданы бесхолестериновые и малохолестериновые спрэды («намазки») типа хальварина и «легкого» сливочного масла, а также безжирового мороженого. Переработка растительной и микробной биомассы позволяет получать высококачественные белки, масла, пектиновые вещества, пищевые волокна, а также белок, сбалансированный по аминокислотному составу, и компоненты нуклеиновых кислот, необходимые для медицинской, пищевой, косметической и других отраслей промышленности. Возникла новая научная дисциплина — экологическая биотехнология, осуществляющая новейший подход к охране и сохранению окружающей среды. Разработаны технологии рекультивации почвы, биологической очистки воды и воздуха и биосинтеза препаратов, компенсирующих вредное влияние измененной окружающей среды на людей и животных. Одна из важнейших задач биотехнологии — ограничение масштабов загрязнения нашей планеты промышленными, сельскохозяйственными и бытовыми отходами, токсичными компонентами автомобильных выхлопов. Современные научные исследования нацелены на создание безотходных технологий, на получение легкоразрушаемых полимеров, в том числе биогенного происхождения, а также на поиск новых активных микроорганизмов — разрушителей полимеров (полиэтилена, полипропилена, полихлорвинила). Усилия биотехнологии направлены на борьбу с пестицидными загрязнениями — следствием неумеренного и нерационального применения ядохимикатов. Ведутся разработки технологий по утилизации вредных выбросов (химикалии, нефть), загрязняющих воду и почву, и сельскохозяйственных отходов типа молочной сыворотки для получения пищевых и кормовых белковых продуктов, в том числе специальных препаратов, обогащенных, например, селеном дрожжей. Повышение цен на традиционные источники энергии (природный газ, нефть, уголь) и угроза их исчерпания побудили ученых обратиться к альтернативным путям получения энергии. Роль биотехнологии в создании экономичных возобновляемых энергетических источников (спиртов, биогенных углеводородов, водорода) чрезвычайно велика. Эти экологически чистые виды топлива можно получать путем биоконверсии отходов промышленного и сельскохозяйственного производства. Перспективно продолжение исследований по усовершенствованию и внедрению процессов производства метана, этанола, созданию на основе микроорганизмов (и ферментов) элементов, эффективно производящих электричество, а также по организации искусственного фотосинтеза, в частности биофотолиза воды, при котором можно получать богатые энергией водород и кислород. Развитие сельскохозяйственной биотехнологии на современном этапе направлено на решение таких глобальных проблем, как повышение плодородия почв, урожайности и качества сельскохозяйственной продукции; рекультивация сельскохозяйственных угодий; улучшение экологической обстановки, способствующей восстановлению биоценоза почв; повышение качества кормов и др. В области медицины весьма перспективной является разработка новых технологий использования молекулярных антител в области диагностики и лечения заболеваний, направленного транспорта лекарственных средств, трансплантологии органов, тканей, клеток, формирования нового класса медицинской техники — индивидуальных биотехнологических систем для контроля состояния организма. Особый интерес представляют принципиально новые направления, развитие которых предполагается осуществить в XXI в: электрохемитерапия, молекулярное моделирование, отдельные области клеточной инженерии (клеточная инкапсуляция, энергетические межклеточные взаимодействия) .ЛИТЕРАТУРА Основная Биология культивируемых клеток и биотехнология растений / Под ред. Р.Г.Бутенко. — М., 1991. Биотехнология / Под ред. А. А. Баева. — М., 1988. Биотехнология растений: культура клеток / Под ред. Р. Г. Бутенко. — М., 1989. жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|