Высшее образование
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
| Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматичес- ком введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь (рис. 5.4). В этом случае обычно используют дидезоксирибо- нуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза-З'-ОН, представленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифицированный нуклеотид, внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК- полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида. Синтез in vitro молекулы ДНК в присутствии затравки (прайме- ра) и небольшого количества одного из таких модифицированных нуклеотидов приводит к образованию фрагментов ДНК в виде «лесенки». Если для получения таких фрагментов применять меченую ДНК (обычно проводят четыре реакции синтеза с использованием различных нуклеотидов, терминирующих цепь), а электро- форетический анализ проводить на четырех дорожках геля, то можно определить последовательность нуклеотидов. В настоящее время используют модифицированный метод, сводящийся к флуоресцентному анализу наборов фрагментов ДНК в процессе движения по одной дорожке геля.
Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 "С в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100 °С комплементарные пары оснований разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит Последовательность нуклеотидов во фрагменте ДНК Рис. 5.3. Схема электрофореграммы, полученной с помощью химического метода секвенирования ДНК (первая снизу строка соответствует нук- леотиду на 5'-конце и является нуклеотидом Т на уровне первой дорожки. Для определения полной последовательности (отмечено пунктиром) проводят анализ послойно всех дорожек к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»). Это свойство ДНК широко используют в химической систематике, а также для решения эволюционных и филогенетических проблем. Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали зависит от вероятности столкновения двух комплементарных нук- леотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Скорость реакции гибридизации можно использовать для определения концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо химическим путем, метят по 32Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочеч-А 5'У///////Л GCTACCTGCATGGA з'ШЯгггШгЕс CGATGGACGTACCTCTGAAGCG ^ gctacctgcatgga Y/МШЛ GCTA УМ////М ГгГТАГГТГ.ГА СИЗ Рис. 5.4. Схема энзиматического метода секвенирования нуклеиновых кислот, основанного на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего цепь: У////////Л жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|