Высшее образование
О 79 IV 88 Глава 4 94
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
19b6c9a
- Бұл бет үшін навигация:
- ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ 486
| О 79
IV 88
Глава 4 94 БИОИНДУСТРИЯ ФЕРМЕНТОВ 94 нон2с—с—с—с—с—сСн +02 + Н20 145 —- нон2с—с—с—с—с—ct + Н202 146
\ Ч 247
О 419 IV 428
Глава 4 434 БИОИНДУСТРИЯ ФЕРМЕНТОВ 434 нон2с—с—с—с—с—сСн +02 + Н20 484 —- НОН2С—с—с—с—с—ct + н2о2 I I I I ^он ОН ОНН он 485
\ Ч 563
ОСНОВЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ 591 Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. coli R6_5 с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур. Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида, относящаяся к группе колициногенных плазмид Е. coli. Col El реплицируется независимо от хромосомы и присутствует в количестве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благодаря селективному маркеру в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. coli. Плазмида ColEl (Mr 4,2 МДа) применяется для клонирования EcoRl-фрагментов. При этом интеграция чужеродного фрагмента в участок узнавания EcoRI ведет к фенотипическому изменению клетки, прекращению синтеза колицина с сохранением иммунности к нему. Этот признак используют при отборе рекомбинантных трансформантов. Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз: EcoRI, Hindlll, BamHI, Sail, Xmal и Hpal. Конструируя рекомбинантную ДНК, в эти участки можно встра ивать фрагменты чужеродной ДНК, полученные с помощью соответствующих рестриктаз. На рис. 5.10 изображена схема расположения генов в плазмиде pBR322. Плазмида pBR322 содержит два гена, программирующих устойчивость к двум различным антибиотикам — тетрациклину (ген tet) и ампициллину (ген Ыа). В гене tet находятся уникальные участки расщепления рестриктаза- ми Hindlll, BamHI и Sail, а в гене Ыа — участок расщепления Pstl. Если разрезать плазмиду любой из рестриктаз, участок расщепления которой находится в гене tet, и соединить ее методом «липких» концов с чужеродным фрагментом ДНК, то в полученной рекомбинантной молекуле останется нетронутым только ген Ыа, а ген tet утрачивает свою активность, так как его целостность нарушается вставкой. Напротив, при разрезании плазмиды рестрик- тазой Pstl и внедрении в этот участок фрагмента ДНК инактиви- руется ген Ыа, тогда как ген tet продолжает кодировать белок, обеспечивающий устойчивость Е. coli к тетрациклину. Плазмид- ные векторы в настоящее время чрезвычайно разнообразны за счет следующих свойств: уменьшения размеров плазмиды вследствие изъятия участков, не обязательных для репликации (чем больше плазмида содержит уникальных участков узнавания для рестриктаз, тем она универсальнее); EcoRI XmnI 4361 Clal 23 ACGI 2246 2246 Snal 2246 Рис. 5.10. Схема строения плазмиды pBR322 Xmalll 939 гибридизации векторов одного рода с другими векторами или природными плазмидами (например, получены гибридные векто ры комбинацией плазмиды и фага X (при этом вновь сконструированная рекомбинантная ДНК должна сохранить репликационные свойства исходной плазмиды); использования новых плазмид; применения транспозонов; создания векторов с генетическими маркерами, позволяющими вести отбор рекомбинантных клонов. Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное применение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы — дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Анализируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, например бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве векторов применяют сконструированные производные фага X и фагов М13 и fd. В векторах на основе бактериофага X используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке. Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага X в качестве вектора. Фаг М13 — это одноцепочечная циклическая ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки одноцепочечная ДНК фага превращается в двуцепочечную реп- ликативную форму (RF), которая подобна плазмиде. Фаговая ДНК содержит, кроме того, короткий участок из 500 нуклеотидов, названный как МП (межгенная последовательность), не существенный для ее жизнедеятельности. Именно в этот участок МП репли- кативной формы ДНК после расщепления ее с помощью лигазы вставляют чужеродную ДНК. Введение рекомбинантной двуцепо- чечной молекулы в клетку Е. coli приводит к ее репликации, синтезу (+) цепи, упаковке последней в белковый чехол и выделению фага в среду. Инфицированная нитевидным фагом клетка продолжает делиться, выделяя в окружающую среду большое количество фага. Этот фаг содержит в вирионе одноцепочечную циклическую ДНК, в которую встроена одна из цепей чужеродной ДНК.
жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|