Высшее образование
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
19b6c9a
- Бұл бет үшін навигация:
- Сахаров
- Органогенез.
- 6.8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ
- 6.8.1. Синтез вторичных метаболитов
| Гистогенез. Главную роль в преобразовании каллусных клеток в сосудистые элементы играют фитогормоны, в основном ауксины. Опыты по влиянию апикальной меристемы побега (место синтеза ауксинов) на гистогенез в каллусной ткани показали, что ниже места прививки апекса в каллусной ткани начинали образовываться сосудистые элементы. Тот же эффект наблюдался при нанесении на каллус ауксина с сахарозой. Интересно, что повышение концентрации сахарозы способствовало образованию элементов флоэмы, а понижение — образованию ксилемных элементов. Причем такое действие оказывала совместно с ауксином только сахароза, что позволяет говорить о ее регуляторной роли. Добавление к гормону других Сахаров гистогенеза не вызывало. В некоторых случаях стимуляторами гистогенеза помимо ауксинов могут быть и остальные фитогормоны. Так, было отмечено, что в каллусных тканях сои этот процесс начинается под действием гиббе- релловой кислоты и этилена.Органогенез. Первые работы Ф.Скуга и С.Миллера по влиянию ауксинов и открытого ими кинетина на органогенез в каллусах растений показали прямую зависимость этого процесса от соотношения фитогормонов. Преобладание концентрации ауксина над цитокинином вызывает дифференцировку клеток, приводя-
протопласты — одни из наиболее ценных объектов в биотехнологии. Они позволяют исследовать различные свойства мембран, а также транспорт веществ через плазмалемму. Главное их преимущество состоит в том, что в изолированные протопласты достаточно легко вводить генетическую информацию из органелл и клеток других растений, прокариотических организмов и из клеток животных. Е. Коккинг установил, что изолированный протопласт благодаря механизму пиноцитоза способен поглощать из окружающей среды не только низкомолекулярные вещества, но и крупные молекулы, частицы (вирусы) и даже изолированные органеллы. Большое значение в создании новых форм растений для изучения взаимодействия ядерного генома и геномов органелл имеет способность изолированных протопластов сливаться, образуя гибридные клетки. Таким способом можно добиться получения гибридов от растений с разной степенью таксономической удаленности, но обладающих ценными хозяйственными качествами. Впервые протопласты были выделены Дж. Клернером в 1892 г. при изучении плазмолиза в клетках листа телореза (Stratiotes abides) во время механического повреждения ткани. Поэтому этот метод назван механическим. Он позволяет выделить лишь небольшое количество протопластов (выделение возможно не из всех видов тканей); сам метод длительный и трудоемкий. Современный метод выделения протопластов заключается в удалении клеточной стенки с помощью поэтапного использования ферментов для ее разрушения: целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы. Этот метод получил название ферментативного. Первое успешное выделение протопластов из клеток высших растений данным методом сделано Е. Коккингом в 1960 г. По сравнению с механическим ферментативный метод имеет ряд преимуществ. Он позволяет сравнительно легко и быстро выделять большое количество протопластов, причем они не испытывают сильного осмотического шока. После действия ферментов смесь протопластов пропускают через фильтр и центрифугируют для удаления неразрушенных клеток и их осколков.
Выделить протопласты можно из клеток растительных тканей, культуры каллусов и суспензионной культуры. Оптимальные условия для изоляции протопластов для разных объектов индивидуальны, что требует кропотливой предварительной работы по подбору концентраций ферментов, их соотношения, времени обработки. Очень важным фактором, позволяющим выделять целые жизнеспособные протопласты, является подбор осмотического стабилизатора. В качестве стабилизаторов обычно используют различные сахара, иногда ионные осмотики (растворы солей СаС12, Na2HP04, КС1). Концентрация осмотиков должна быть немного гипертонична, чтобы протопласты находились в состоянии слабого плазмолиза. В этом случае тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки. 7 Г-'горова Изолированные протопласты можно культивировать. Обычно для этого используют те же среды, на которых растут изолированные клетки и ткани. Сразу же после удаления ферментов у протопластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолированная клетка, способен делиться и формировать клон клеток. Регенерация целых растений из изолированных протопластов сопряжена с рядом трудностей. Получить регенерацию через эмбриогенез удалось пока только у растений моркови. Стимуляцией последовательного образования корней и побегов (органогенез) добились регенерации растений табака, петунии и некоторых других растений. Следует отметить, что протопласты, изолированные из генетически стабильной клеточной культуры, чаще регенерируют растения и с большим успехом используются при исследованиях генетической модификации протопластов. 6.8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ В СОЗДАНИИ СОВРЕМЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
6.8.1. Синтез вторичных метаболитов В настоящее время известно примерно 2-104 синтезируемых растениями веществ, которые используются человеком, и их количество постоянно увеличивается. Растения всегда служили источником пищи, эфирных масел, красителей и, конечно же, лекарственных соединений. Так, мак снотворный (Papaver somniferum)j является источником болеутоляющего вещества — кодеина; из на^ перстянки (Digitalis lanata) получают дигоксин, тонизирующий сер| дечную деятельность; из хинного дерева (Cinchona ledgeriana) -4 антималярийное средство «хинидин». Особое место занимают нар| котики и стимулирующие вещества. В небольших, строго контро! лируемых количествах их используют в медицине. Однако при сй|Биотехнологическое применение
|| L м н II . фундаментальные : исследования Вегетативное : размножение ■ Оздоровление Искусственные семена Вторичные продукты и биотрансформация Гибридизация: половая, соматическая Гаплоидизация: андро генная, гиногенная Селекция, мутации, вариации Замена органелл Меристемы, яйцеклетки, эмбрионы, микроспоры пыльники ===== н Каллус Протопласты Молекулярно- генетическая инженерия растений Рис. 6.5. Использование культуры клеток и тканей растений в биотехнологии (по Х.Борнман, 1991) стематическом употреблении низких концентраций наркотиков возникают наркозависимость и стремление к увеличению употребляемой дозы. Применение высоких концентраций наркотика убивает человека. Наиболее известны опиум и героин из Papaver somniferum, кокаин из Erythroxylon, никотин из различных сортов табака. Наиболее известный стимулятор — кофеин, содержащийся в растениях чая и кофе. Стимуляторы не токсичны в концентрациях, рекомендуемых к применению. Однако высокие их концентрации негативно влияют на сердечно-сосудистую и нервную систему человека. Большой интерес вызвало открытие пиретринов, выделенных из цветков Chrysanthemum cinerariaefolium. Эти вещества — мощные инсектициды. Особая их ценность заключается в том, что пиретрины не вызывают привыкания у насекомых, а также не проявляют кумулятивного токсического эффекта. Способность интактных растений синтезировать различные соединения привела к предположению, что тем же свойством будут обладать клетки и ткани этих растений, выращиваемые в стерильных условиях. Для некоторых культур это оказалось справедливым. Но в отдельных случаях клетки либо не проявляли способности к синтезу необходимых веществ, либо синтезировали их в минимальных количествах. Понадобились долгие эксперименты по подбору питательных сред, условий культивирования, исследованию новых штаммов, полученных благодаря генетической гетероген ности каллусных клеток или применению мутагенных фактороь чтобы добиться серьезных успехов в этой области. В настоящее время промышленный синтез вторичных метабо литов — очень перспективное направление. Синтез вторичны: метаболитов происходит главным образом в суспензионной культуре клеток, в регулируемых условиях, поэтому он не зависит о~ климатических факторов, от повреждения насекомыми. Культурь выращивают на малых площадях в отличие от больших массивоь плантаций с необходимыми растениями. Культуры клеток растений могут синтезировать практически все классы соединений вторичного обмена, причем довольно часто в количествах, в нескольк< раз превышающих их синтез в целых растениях. Например, выхол аймалицина и серпентина в культуре клеток Catharanthus roseur составляет 1,3 % сухой массы, а в целом растении — 0,26 %. В культура- клеток Dioscorea deltoidea диосгенин синтезируется в количеств^ 26 мг на 1 г сухой массы, а в клубнях растений его содержание составляет 20 мг на 1 г сухой массы. Кроме того, в культурах ют- ток может начаться синтез веществ, не характерных для исходного растения, либо расширяется набор синтезируемых соединений В ряде случаев в клеточной культуре образуются вещества, которые синтезировались интактным растением на ювенильной фаз:- развития, либо вещества, содержавшиеся в клетках филогенетически более ранних групп растений. Так, в культуре клеток Papave bracteatum содержится сангвирин, характерный для ювенильны:. растений, и отсутствует тебаин, синтезируемый взрослыми растениями. А в культуре клеток живокости (Delphinium) синтезируются Д7-стерины, присутствующие у архаичных групп растений. Синтез вторичных соединений может коррелировать с процессом дифференцировки в культуре клеток. Например, в суспензионной культуре Papaver somniferum максимальный синтез алкалоидов начинается после того, как в ней дифференцируется достаточна большое количество специализированных клеток млечников, предназначенных для депонирования метаболитов. С другой стороны, культуры клеток табака и моркови синтезируют большое количество никотина и антоцианина соответственно, хотя их клетки слабо дифференцированы. Не существует также однозначного ответа на вопрос, как связан синтез вторичных метаболитов с ростовым» процессами. У большого числа культур вторичные метаболиты син; тезируются и накапливаются в значительных количествах либо в? время экспоненциальной фазы, когда ростовые процессы особен* но активны, либо в период стационарной фазы роста культура клеток, когда прирост клеточной массы прекращается. Однако ecti культуры, например культура клеток Catharanthus roseus, у которь: синтез вторичных метаболитов сопровождает весь период роста. | Важная особенность культивируемой популяции клеток — е стабильность в отношении синтеза и накопления продуктов вто| ричного синтеза. Так, в отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН под руководством Р. Г. Бутенко были получены разные штаммы клеток Dioscorea deltoidea, в том числе штамм-сверхпродуцент ИФР ДМ-0,5. Все эти штаммы сохраняли стабильность в отношении синтеза фуростаноловых гликозидов около 26 лет. Интересная особенность большинства клеток в культуре состоит в том, что обычно эти клетки не транспортируют синтезируемые метаболиты в питательную среду или другие клетки, хотя некоторые культуры составляют исключение, в частности культура клеток мака, которые депонируют алкалоиды в млечники. Синтез вторичных метаболитов в культивируемых клетках связан с внутриклеточными органеллами, в основном с пластидами и эндоплаз- матическим ретикулумом. В клетках, не способных к транспорту метаболитов, продукты вторичного синтеза обычно накапливаются в вакуолях и свободном пространстве (СП) клеток (табл. 6.3). На синтез вторичных метаболитов влияет целый ряд факторов. Прежде всего выход продукта зависит от генотипа растения-до- нора. Показано, что культуры клеток, полученных от высокопродуктивных растений, продуцировали большее число метаболитов. Другой важный фактор — состав питательной среды и концентрация ее компонентов, которые должны обеспечивать, с одной стороны, увеличение количества клеток-продуцентов, с другой —
жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|