Clostridium Cellulolyticum

 
 
90 
ферменттеу  кезінде  дами  алады  [108].  C.  thermocellum  әлеуетті  тұрғыда  ҚБҚ  ағзасы  болуы  мүмкін 
болғанымен,  трансформация  тиімділігінің  төмендігі  және  C.  thermocellum-да  бөтен  ақуыздардың 
табысты артық айқындалуын көрсететін жарияланымдардың жоқтығы сияқты мәселелер изобутанол 
сияқты синтетикалық биоотын алу үшін осы ағзаның технологиялық ілгерілеуін едәуір қиындатады 
[109]. 
Биоотын  өндіру  тәсілдерінің  бірі  –  алдымен  тығыз  байланысты,  неғұрлым  қолайлы  ағзада 
метаболизмнің  қалаған  жолдарын  орнату  және  оңтайландыру.  Қандай  гендерді  артық  айқындау, 
мутациялау  және/немесе  жою  керектігі  сияқты  өзіне  тән  ерекшеліктерді  анықтағаннан  кейін,  сол 
стратегияны  С.thermocellum  үшін  бейімдеуге  болады.  Clostridium  cellulolyticum,  бастапқыда 
ыдыраған  шөптен  бөлінген  [110],  метаболизмдік  инженерия  бойынша  осы  бастапқы  жұмысқа 
пайдалы кандидат болып табылады, себебі ол сондай-ақ 16s РНК филогенетикалық талдау негізінде 
Clostridium  III  тобының  мүшесі  болып  табылады  [111].  Басқа  артықшылығы  –  оның  мезофильді 
сипаты,  ол  оларды  қоршаған  жылу  сүйгіш  ақуыздардың  гетерологиялық  айқындалуымен 
байланысты.  Сонымен  қатар,  C.cellulolyticum  генмен  (ГенБанкі,  инвентар.  NC_011898.1)  және  ол 
үшін ДНҚ-ны тасымалдаудың жақсы дамыған әдістері [112] және гендердің аса айқындалу әдістері 
бар [113]. Өзі ҚБҚ әлеуетті ағзасы бола отырып, Cellulolyticum С. thermocellum ұқсас целлюлозаны 
ғана емес, сондай-ақ ксилозаны, арабинозаны, фруктозаны, галактозаны, маннозаны және рибозаны 
қоса алғанда, гемицеллюлозаны ыдырату кезінде бөлінетін қосымша қантты пайдалана алады [114]. 
Бұрын C. cellulolyticum этанол өндірісін жақсарту үшін генетикалық тұрғыда түрлендірілген болатын 
[113].  Сол  сияқты,  ҚБҚ  ағзасын  құруға  қатысты  зерттеулердің  көпшілігі  этанол  өндірісінде 
шоғырланған. 
Осыған  қарамастан,  изобутанол  сияқты  жоғары  спирттер  (яғни  екі  көміртегі  атомынан  артық 
спирттер) бензинді алмастыру үшін ең жақсы кандидаттар болып табылады, өйткені оларда энергия 
тығыздығы, октандық саны және бензин қасиеттеріне ұқсас болып табылатын Рейд бу қысымы бар 
[115].  Изубутанолдың  этанолдан  айырмашылығы,  ол  бензинмен  кез  келген  қатынаста  немесе 
өзгеріссіз  араласуы  мүмкін,  заманауи  қозғалтқыштарды  тәікелей  қолданылуы  мүмкін  [116]. 
C.cellulolyticum,  метаболизм  көзқарасы  тұрғысынан  изобутанол  өндірісі  үшін  өзгертілген.    Валин 
биосинтезінің  өзгертілген  жолын  пайдалана  отырып,  пируваттың  изобутанолға  түрлендірілуін 
басқаратын  ферменттерді  айқындау  арқылы,  біз  кристалды  целлюлозада  өсетін  C.  cellulolyticum 
пайдалана  отырып,  660  мг/л  дейін  изобутанол  ала  алдық.  Атап  айтқанда,  біз  осы  микроағзаларды 
пайдалана  отырып,  кристалды  целлюлозадан  шамамен  660  мг/л  изобутанолдың  алғашқы  өндірісін 
растадық  [117]..  Пируваттан  изобутанол  өнімін  тікелей  алу  үшін  B.subtilis  -  тен 
ацетолактатсинтазаны,  ацетогидроксик  қышқыл  изомероредуктазасын,  Е.Сoli  –  ден  дигидроксик 
қышқылының  дегидратазасын  және  кетоқышқылды  декарбоксилазасын,  Lactoccus  lactis  спиртінен 
дегидрогеназасын  кодтайтын  гендер  pAT187  плазмидасының  туындыларына  клондалған  (5.4  – 
суретін қараңыз) [118]. Бұл ерекше гендердің таңдалынып алынған себебі – бұл гендердің E.coli – де 
[119]    және  Synechococcus  elongatus  –  те  [120]  изобутанолды  өндіру  үшін  дәл  сол  гендердің 
қолданылуы.  Гендердің  әртүрлі  комбинациялары  тұрақты  ферродоксинді  (Fd)  Clostridium 
pasteurianum  жеделдеткішімен  басқарылатын  бірыңғай  синтетикалық  оперон  түрінде  клондалған. 
Изобутанол жолындағы алғашқы үш ферменттердің белсенділігі C.cellululolyticum-да alss немесе alsS 
ilvCD  айқындайтын  плазмиданы  трансформациялау  арқылы  зерттелді.  В  то  время  как  C. 
cellulolyticum  был  успешно  трансформирован  с  помощью  пустого  вектора,  но  трансформанты  C. 
cellulolyticum  alsS  или  alsS  ilvCD  не  были  получены.  C.  cellulolyticum  бос  вектор  арқылы  сәтті 
трансформацияланғанда,  C.  cellulolyticum  alsS  немесе  alsS  ilvCD  трансформанттары  алынбаған 
болатын.  Осындай  нәтижелер  бірнеше  рет  түрлендіруден  кейін  де  байқалды.  AlsS  және  alsS  ilvCD 
трансформанттарының  алынбауына  байланысты,  изобутанолдың  толық  жолы  зерттелді.  C. 
cellulolyticum трансформировали плазмидой, экспрессирующей alsS ilvCD kivd adhA. C. cellulolyticum 
–  ді  Аlss  ilvCD  kivd  adhA  айқындауыш  плазмидамен  өзгертті.  Трансформация  пайда  болған  кезде 
плазмида  дәйектілігінің  растамасы  alsS  бірізділігінің  өзгермеген  түрінде  анықталмаған  адениннің 
жалғыз ендірмесінің б.т. 54 кезінде анықталғанын көрсетті, ATG үдерісі басталғаннан кейін. Бұл дара 
ендірме, оқу шеңберін жылжыта отырып, төмен тұрған мезгілсіз тоқтату  – кодонының (TGA) және, 
37 амин қышқылынан сіңірілген ақуыздың пайда болуына әкеледі. АlsS (* alsS) – ғы бұл кенет өзгеріс 
клондау  үшін  қолданылатын          E.Сoli  штаммынан  пайда  болғаны  анықталды.  AlsS  жүйелілігінде 
шеңбердің жылжу өзгерісі AlsS белсенділігіне тигізуі мүмкін әсерден қатты алаңдаушылық тудырды.  
Осылайша,  синтетикалық  опероннан  айқындалатын  AlsS  және  басқа  да  ферменттердің 
белсенділігін  анықтау  үшін  C.cellulolyticum  штаммының  лизатасында  *  alsS  ilvCD  kivd  adhA 
айқындаушы ферменттік талдаулар жүргізілді. 

жүктеу/скачать 4,71 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: