Жас ғалымдардың VII халықаралық Ғылыми конференциясының материалдары 25-26 сәуір 2011 жыл



жүктеу 4.37 Mb.
Pdf просмотр
бет3/31
Дата28.12.2016
өлшемі4.37 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   31

1.1.2. Собственно микроразмножение 
На  следующем  этапе  полученные  микропобеги  в  стерильном  боксе  отделяли 
скальпелем  от  экспланта  и  помещали  на  свежую  питательную  среду.  Для  выращивания 
побегов  в  среду  MS  были  добавлены  регуляторы  роста  в  различных  концентрациях  и 
сочетаниях.  Наибольший  прирост  побегов  (1,8  см)  в  высоту  наблюдался  на  питательной 
среде с содержанием α-НУК (0,1 мг/л) и  6-БАП  (0,5 мг/л). 
В  работе  по  стимуляции  ризогенеза  у  побегов  J.  sibirica  В.  варьировали 
концентрацией гормонов и составом питательных сред. Ризогенез наблюдали на побегах   J. 
sibirica В., культивируемых сначала на среде  Uata с добавлением ИУК (0,05 мг/л) в течение 
месяца,  затем  на  среде  МS/2  в  течение  трех  месяцев.  Появление  первых  корней  на 
эксплантах  J.  sibirica  В.    отмечали  к  концу  15-й  недели  (рисунок  1д).  Образование  корней 
происходило на безэпитальной части побега. Максимально достигнутый процент укоренения  
побегов J. sibirica составил 17,50 % 
1.1.3 Адаптация пробирочных растений к условиям in vivo 
Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является сложной 
операцией.  Поэтому  при  пересадке  растений-регенерантов  были  созданы  условия, 
идентичные с их развитием в условиях in vitro.  
Развившиеся из почек побеги в стерильном боксе отделяли скальпелем от экспланта и 
помещали  на  агаризованную  среду  в  пробирки  для  выращивания.  Питательная  среда 
содержала  макро-  и  микроэлементы  по  МS  с  добавлением  витаминов,  сахарозы,  агара  и 
регуляторов  роста  6-БАП  (0,5мг/л)  и  α-НУК  (0,1  мг/л).  Побеги  культивировали  на  данной 
питательной  среде  в  течение  двух  месяцев.  Для  индукции  ризогенеза  использовали 
двухстадийную систему культивирования. На первой стадии культивировали на стандартной 
среде  Uata  с  добавлением  ИУК  (0,05  мг/л)  в  течение  месяца,  затем  MS/2  в  течение    трех 
месяцев. Процент укоренившихся в условиях in vitro побегов составил 17,50 %. 
Полученные растения осторожно вынимали из пробирок, корневую  систему побегов 
отмывали  от  агара  дистиллированной  водой,    помещали  в  горшочки  для  рассады,  на  1/3 
заполненные торфо-перлитной смесью  в соотношении 1: 2, и накрывали полиэтиленовыми 
изоляторами. Горшочки с растениями помещали в теплицу с температурным режимом (22 

 
1) 
0
С  и  относительной влажностью  60  %.  Количество  адаптированных  растений  на  данном 
этапе составило 91,60 %. 
1.2.  Микроклональное  размножение  диффференциацией  адвентивных  почек  в 
первичной и пересадочной каллусной ткани можжевельника сибирского 
Влияние способа культивирования на рост каллусной ткани Juniperus 
S
ibirica В. 
Известно, что наиболее важными компонентами питательной среды, определяющими 
каллусогенез,  являются  регуляторы  роста.  Модификации  подвергается  в  первую  очередь 
гормональная составляющая питательной среды, в связи с этим основной целью этого этапа 
было  изучение  влияния  экзогенных  регуляторов  роста  на  каллусогенез  и  рост  культуры 
клеток можжевельника сибирского. 
1.2.1 Исследование каллусообразования на средах MS с различным содержанием 
фитогормонов 

 
16 
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
Продолжительность культивированияя, сут
М
ас
са 
 к
ал
л
ус
а,
  мг
  
При  исследовании  роли  гормонов  в  индукции  каллусогенеза  было  исследовано  25 
модификаций  питательной  среды  MS,  которые  отличались  качественным  составом  и 
количественным содержанием фитогормонов .  
Начало  каллусообразования  на  различных  средах  варьировало  от  8  до  27  сут.  На 
среде,  не  содержащей  регуляторов  роста,  инициации  каллусной  ткани    не  наблюдалось. 
Присутствие в питательной среде экзогенного регулятора 2,4-Д оказало наибольшее влияние 
на процесс инициации каллусогенеза. 
Для  получения  каллусной  культуры  были  использованы  экспланты  разных  органов 
растения.  Каллусогенез  инициировали  из  эксплантов  хвои,  почек,  сегментов  стебля  и 
побегов на средах с различными концентрациями 2,4-Д. 
Результаты эксперимента показали, что первичный каллус  удалось получить из всех  
типов эксплантов, но не на всех средах. Инициирование каллусной ткани из хвои Juniperus 
sibirica  B.  наблюдали  только  на  среде  с  добавлением  2,4-Д  в  количестве  0,6  мг/л. 
Каллусогенез  из  эксплантов  почек  и  побегов  можжевельника  сибирского  наблюдался  на 
многих средах (рисунок 1). 
 
Влияние концентрации и вида гормонов в среде на инициацию побегов 
Juniperussibirica В
 
.
 
Рисунок 1 
Таким  образом,  в  результате  проведенного  эксперимента  установлено,  что 
эффективность каллусообразования зависит не только от вида эндогенного регулятора роста 
и  его  концентрации,  но  и  от  типа  экспланта.  Лучшими  эксплантами  для  индукции  каллуса 
оказались побеги и почки J. sibirica B., менее эффективными – сегменты стебля.  
 
Динамика роста каллусной ткани можжевельника сибирского на средах с различным 
содержанием гормонов
 
Рисунок 2 

 
17 
Динамика  роста  каллусной  ткани  в  зависимости  от  продолжительности 
культивирования  приведена  на  рисунке  6.  В  качестве  контроля  была  использована 
безгормональная  среда.  В  процессе  культивирования  в  течение  44  сут  среднее  увеличение 
массы  произошло  в  2,7  раза.  В  результате  проведенного  эксперимента  установлено,  что 
отсутствие  в  питательной  среде  цитокининов,  в  данном  случае  кинетина,  не  приводило  к 
остановке роста ткани (рисунок 2).  
Полученные  результаты  свидетельствуют  о  том,  что  данную  культуру,  как  и 
большинство других культур клеток, можно отнести к ауксинозависимой. Однако наличие в 
среде  кинетина  имело  важное  значение,  так  как  взаимодействие  ауксина  (2,4-Д)  с 
цитокинином (кинетином) обеспечивало более интенсивный рост культуры, чем присутствие 
в  среде  только  2,4-Д.  Максимальное  накопление  сырой  биомассы  за  ростовой  цикл 
наблюдалось на среде, содержащей 0,2 мг/л 2,4-Д + 0,2 мг/л кинетина, и составило 228,5 мг 
на пробирку. 
1.3 Исследование динамики роста каллусной ткани на агаре и пенополиуретане 
Известно, что большое влияние на накопление продуктов вторичного метаболизма в 
условиях  in  vitro  оказывают  способы  культивирования  растительной  ткани.  Была 
исследована динамика роста каллусной ткани при  поверхностном культивировании на агаре 
и  инертном  носителе  -  пенополиуретане  с  периодическим  омыванием  ткани  питательной 
средой.  Чувствительность  клеток  растений  к  механическому,  осмотическому  и 
трофическому  стрессам,  а  также  к  температуре,  рН,  давлению  и  к  химически  активным 
веществам  существенно  ограничивает  выбор  методов  и  инертного  носителя  для 
иммобилизации клеток растений. 
Выбор  пенополиуретана  в  качестве  инертного  носителя  для  выращивания  тканей 
Juniperus sibirica Вбыл обусловлен существенными преимуществами этого материала. Это 
дешевизна,  удобство  манипулирования,  возможность  многократно  использовать  носитель. 
Пористость  этого  материала  обусловливает  хороший  доступ  веществ  питательной  среды  к 
клеткам 
Рост  культивируемых  на  пенополиуретановых  подложках  растительных  клеток 
отличался  по сравнению с культурой на агаре. 
Наблюдалась  более  короткая  лаг-фаза  и  более  раннее  вступление  в  фазу 
экспоненциального  роста    (16-18  сут.)  и  еѐ  большая  продолжительность.  Увеличение  
клеточной  биомассы  в  10  раз  происходило  примерно  на  32-е  сутки.  Очевидно,  что  при 
культивировании  на  пенополиуретановых  подложках    улучшаются  условия  кислородного 
обмена и обмена элементами питательной среды. 
2.
 
Экономическое обоснование семенного и микроклонального  размножения 
хвойных пород 
При  определения  показателей  эффективности  выращивания  сеянцев  были  учтены 
следующие основные затраты; подготовка посадочного материала, уход за ними, подготовка 
почвы  и  высадка  в  открытый  грунт.  Однако  наибольшую  трудность  в  организации 
биотехнологической  лаборатории  для  микроклонирования  представляет  высокая  стоимость 
не только оборудования и приборов, но, главное, необходимых реактивов для приготовления 
питательных сред. 
Экономические  затраты  на  выращивание  хвойных  растений  в  культуре  in  vitro 
превосходят  стоимость  семенного  посадочного  материала,  однако  использование 
технологии  микроразмножения  для  высокопродуктивных  безвирусных  селектированных 
клонов  и  видов  позволяет  получить  высокую  рентабельность.  Кроме  того,  постепенное 
совершенствование  методов  клонального  микроразмножения  обеспечат  широкое 
внедрение в реализацию  программ генетического улучшения хвойных пород в Республике 
Казахстан. 
3.
 
Личное мнение об актуальности проделанной работы 

 
18 
Подводя  итог,  хочу  смело  сказать,  что  клональное  микроразмножение  является 
перспективным  способом  вегетативного  размножения  растений,  позволяющим  получать 
генетически однородный, оздоровленный посадочный материал.  
Человечество  современного  мира  в  первую  очередь  должно  задаваться  глобальным 
вопросом: Выживет ли оно спустя десятки, тысячи лет на земле, где сейчас твориться хаос? 
Ведь  спустя  некоторое  время  у  нас  могут  иссякнуть  водный  запас,  исчезнуть  многие  виды 
растений  и  животных,  что  поведет  к  нарушению  пищевой  цепочки,  а  атмосфера  станет 
полностью  загазованной.  Поэтому  каждый  должен  сделать  вклад,  чтобы  избежать  такую 
ситуацию.  В  нашем  случае  хочется  сказать  об  озеленении  земной  поверхности  древесно-
кустарниковыми растениями именно хвойных пород. 
Так  как  они  лучше  выполняют  фитосанитарную  роль,  нежели  лиственные  деревья  и 
кустарники.  Исходя  из  актуальности  темы,  думаю,  нужно  глубже  внедрять,  развивать  и 
усовершенствовать технологию микроклонального размножения в нашем Государстве.  
Заключение 
На  основании  полученных  данных  научно-исследовательской  работы  были  сделаны 
следующие выводы: 
1.Подобраны  оптимальные  условия  для  введения  в  культуру  in  vitro  эксплантов 
можжевельника сибирского.  
Наиболее высокий процент калусогенеза (до 100%) наблюдался при использовании в 
качестве эксплантов почек и побегов. Установлено, что наилучшей средой, обеспечивающей 
процессы  жизнедеятельности  эксплантов  можжевельника  сибирского  является  стандартная 
среда с минеральной основой по Murashige and Skoog. 
2.Установлено,  что  для  черенкования  in  vitro  можжевельника  сибирского  наиболее 
оптимальной  питательной  средой  является  среда  МС  с  добавлением  α-НУК  (0,1  мг/л)  и  6-
БАП  (0,5 мг/л). Успешное укоренение происходило на среде Uata с добавлением ИУК (0,05 
мг/л) в течение месяца, затем на среде МS/2  в течение трех месяцев. Максимальный процент 
укоренения    побегов  составил  17,50  %.  Количество  адаптированных  растений  на  торфо-
перлитных смесях  в соотношении 1: 2,составило 91,60 %  
3.Разработаны  оптимальные  параметры  технологии  микроклонального  размножения 
можжевельника сибирского в условиях in vitro.  
 
 
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНГИСТАЗИСА ПОЧВ СЕВЕРНОГО КАЗАХСТАНА С 
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНСОРЦИУМОВ НА ОСНОВЕ МИКРООРГАНИЗМОВ 
 
Ботбаева Ж.Т., Мустафина И.Е., Аюпова А.Ж., Жамангара А.К.
,
 
 
Науанова А.П. 
РГП «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан, Казахский 
агротехнический университет имени С. Сейфуллина, г.Астана 
 
В  настоящее  время  регулирование  почвенного  фунгистазиса  относится  к  числу 
перспективных  направлений  в  разработке  мер  борьбы  с  болезнями,  возбудители  которых 
передаются через почву.  
Возбудители  корневых  гнилей  зерновых  культур  относятся  к  почвенным  грибам.  В 
связи  с  этим  эффективность  биопрепаратов,  используемых  для  подавления  почвенных 
инфекций,  во  многом  зависит  от  способности  антагониста  приживаться  и  развиваться  в 
ризосфере  растений  на  протяжении  всего  периода  вегетации.  Внесенные  в  почву 
антагонисты влияют на жизнедеятельность фитопатогенов в почве и ризосфере, безусловно, 
оказывая влияние на фунгистазис почвы. 
Состояние  покоя  патогенов  в  почве  может  быть  вызвано  фунгистазисом,  широко 
распространенным  в  естественных  почвах,  проявляющимся  как  неспецифическое 
ингибирование прорастания пропагул. Наиболее сильно фунгистазис проявляется в почвах с 
большим  количеством  микроорганизмов  и  дефицитом  питательных  веществ.  При 

 
19 
добавлении  органического  материала  и  под  влиянием  корневых  выделений  растений 
покоящиеся  пропагулы  начинают  прорастать.  В  отсутствии  восприимчивого  хозяина 
проросшие гифы могут быть лизированы до образования новых устойчивых форм [1].  
Фунгистазис может быть направлен на выявление разных факторов, которые отвечают 
за развитие и взаимодействие грибов, находящихся в почве. Из почвы изолированы вещества, 
отвечающие  за  фунгистатический  эффект,  и  вещества,  аннулирующие  его.  Показано,  что 
ингибиторы  находятся  в  почве  рядом  со  стимуляторами  в  состоянии  неравновесия.  Если 
доминируют  ингибиторы,  то  конидии  грибов  лишены  возможности  прорастать,  а 
доминирование  стимуляторов  является  толчком  для  начало  развития  гриба.  При  этом  не 
подразумевается  строго количественный учет отдельных веществ, поскольку в естественных 
условиях провести его невозможно, равно как и невозможно выявить ситуации, при которых 
фунгистатическое  воздействие  переходит  в  фунгицидное.  Процесс  ингибирования 
прорастания  конидий  грибов,  обусловливаемый  метаболитами  микроорганизмов,  можно 
ослаблять,  применяя  тепловую  стерилизацию  почвы.  Уменьшение  фунгистазиса  можно 
достичь при добавлении в почву ряда углеводов, которые стимулируют прорастание конидий 
[2, 3]. 
Конидии  фитопатогенных  грибов  способны  длительное  время  сохраняться  в 
состоянии  естественного  или  вынужденного  покоя  под  воздействием  фунгистазиса  почвы. 
Высокая  чувствительность  к  фунгистазису  возбудителей  грибных  болезней  отмечена 
многими авторами [4].  
В  настоящее  время  регулирование  почвенного  фунгистазиса  считается  одним  из 
перспективных направлений для ограничения почвенных грибов. Оценку чувствительности к 
фунгистазису почвы проводили методом сдвоенных целлофановых дисков [5].  
Объектами  исследовании  были  консорциумы  на  основе  микроорганизмов  которые, 
состоят  из  штаммов  бактерий:  -  Консорциум  1:  Bacillus  subtilis  штамм  29,Bacillus  cereus 
штамм 9, Basillus cereus штамм 31, Basillus subtilis штамм 2). Консорциум 2: Basillus pumilus 
штамм 46, Bacillus cereus штамм 9, Basillus pumilus штамм 18, Basillus cereus штамм.  
Также  нами  были  взяты  для  проведения  сравнительного  анализа  фунгистазиса 
биологические  препараты  импортного  производства  такие  как  «Экстрасол»  и 
«Агростимулин».  Для  изучения  фунгистазиса  почвы  под  воздействием  консорциумов  в 
качестве  тест-культуры  взяты  конидии  гриба  Bipolaris  sorokinianа.  В  качестве  контроля 
использовали  стерильную  почву,  которую  инокулировали  суспензией  конидий  того  же 
гриба.  Наблюдения  за состоянием  конидий проводили  через  24  часа  их  контакта  с  почвой. 
Для 
выяснения 
влияния 
биологически 
активных 
веществ 
консорциумов 
на 
жизнедеятельность  фитопатогенов  проверяли  фунгистазис  почвы  к  возбудителям 
гельминтоспрориоза (таблица 1).  
 
Таблица  1  –  Влияние  фунгистазиса  почвы,  обработанной  биопрепаратами  на 
прорастание конидий гриба B. Sorokinianа 
№ 
Вариант 
Число проросших конидий, % Фунгистазис почвы, % 
1  Контроль (нестерильная почва) 
53,6 

2  Контроль (нестерильная почва) 
40,2 
25,0 
3  Консоррциум 1 
31,0 
42,1 
4  Консоррциум 2 
20,0 
62,6 
5  Агростимулин 
34,9 
34,9 
6  Экстрасол 
40,4 
24,6 
 
Результаты опытов показали, что прорастание конидий грибов  B.sorokiniana заметно 
подавляется  при  контакте  с  нестерильной  почвой.  Биологически  активные  вещества, 
выделяемые  консорциумами,  отрицательно  действовали  на  прорастание  возбудителя 
гельминтоспориоза.  Фунгистазис  почвы  по  этим  вариантам  составил  от  24,6%  до  62,6% по 

 
20 
сравнению  с  контролем.  Нестерильная  почва  на  контрольном  варианте  подавляла 
прорастание  конидий  B.  sorokiniana  на  40,2%.  Следует  отметить,  что  под  воздействием 
биопрепарата  Агростимулин  также  наблюдается  фунгистатический  эффект  -  количество 
проросших  спор  не  превышает  34,9%.  Наибольший  уровень  прорастания  спор  патогена 
отмечается  в  почве  с  внесением  Экстрасола.  В  лабораторных  опытах  в  течение  24  часов 
конидии прорастали до 40,4%. Число конидий гриба  B. sorokiniana  были способны к росту 
(20%)  при  внесении  в  почву  Консорциума  2.  Наибольший интерес  для  дальнейшей  работы 
представляет Консорциум 2, отличающиеся в опытах с низким числом роста конидии гриба 
B.sorokiniana. 
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что внесение в почву 
консорциумов  микроорганизмов  рода  Bacillus  значительно  повышает  фунгистазис  почвы  в 
ризосфере  и  приводит  к  ее  оздоровлению,  создавая  благоприятные  условия  для  роста  и 
развития сельскохозяйственных культур. 
Литература 
1.
 
Шешегова  Т.К.,  Вредоносность  фузариозов  пшеницы  в  Кировской  области  // 
Защита и карантин растений. – 2008. № 2. – С. 29 –30.  
2.
 
Gabriele  Berg, Annette  Krechel, Michaela Ditz, Richard A. Sikora, Andreas Ulrich and 
Johannes  Hallmann  Endophytic  and  ectophytic  potato-associated  bacterial  communities  differ  in 
structure  and antagonistic function against plant pathogenic fungi // FEMS Microbiolocy Ecology. – 
2001. – V. 51. – I. 2,1. – P. 215-229. 
3.
 
Бенкен  А.А.,  Гришечкин  С.Д.,  Хацкевич  Л.К.,  Магила  А.С.  Формирование 
почвенной инфекции обыкновенной корневой гнили ячменя // Микология и фитопатология.  
– 1990. – Т. 24, В.4. – С. 336-343. 
4.
 
Мандрик  М.Н.,  Купцов  В.Н.,  Гирилович  Н.И.,  Дэй  Э.,  Коломиец  Э.И.  Новые 
подходы  к  созданию  биопестицидов  для  защиты  зернобобовых  культур  от  болезней 
//Микробные  биотехнологии:  фундаментальные  и  прикладные  аспекты.  МИНСК,  Изд.  И.П. 
Логвинов, 2007. –С.185. 
5.
 
Доценко А.С. Обоснование мер борьбы с инфекцией вертициллеза хлопчатника в 
Киргизской ССР: автореф. канд. биол. наук. Л., 1972. – 25 с. 
 
 
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ОЧИСТКИ MTOR КОМПЛЕКСОВ 
 
Булгакова О.В. 
докторант ЕНУ им. Л.Н. Гумилева, г.Астана 
Научный руководитель – академик НАН РК Берсимбай Р.И. 
 
Мишень 
рапамицина 
млекопитающих 
(mTOR) 
центральный 
компонент 
консервативного  сигнального  пути,  играющий  ключевую  роль  в  регуляции  клеточной 
физиологии.  Согласно  биохимическим  исследованиям    последних  лет  mTOR  входит  в 
качестве  каталитической  субъединицы  в  состав  двух  различных  комплексов  –  mTORC1  и 
mTORC2. mTORC1 осуществляет регуляцию биосинтеза белка и рибосомального биогенеза 
путем  фосфорилирования  S6K1  и  4EBP1.  Киназа  Akt,  ключевое  звено  многочисленных 
сигнальных  путей,  является  даунстрим  регулятором  mTORC2.  В  работе  рассматриваются 
методы очистки mTOR комплексов. 
Введение 
mTOR  (мишень  рапамицина  млекопитающих,  англ.  mammalian  target  of  rapamycin
играет важную роль в регуляции клеточного роста и метаболических изменений в клетке  в 
ответ  на  действие  различных  внешних  и  внутренних  стимулов  таких  как  поступление 
питательных  веществ  в  клетку,  содержание  АТФ,  стимуляция  первичными  мессенджерами 
(например,  факторами  роста).  Нарушение  регуляции  mTOR  сигналинга    отмечено  при 
развитии  онкологических  опухолей  различного  генеза.  В  последние  годы  результаты 

 
21 
многочисленных  научных  экспериментов  позволили  выявить  ключевые  моменты    mTOR 
сигнального пути.  
TOR,  известный  также  как  FRAP  (FKBP12-Rapamycin-associated  Protein,  FKBP12-
рапамицин  ассоциированный  белок),  представляет  собой  крупный  белок  (289  кД), 
относящийся  к  семейству  PIKK  (phosphoinositide  kinase-related  kinases,  фосфоинозитид 
родственных  киназ).  mTOR  в  виде  каталитической  субъединицы  входит  в  состав  двух 
различных комплексов – mTORC1 и mTORC2.  
mTORC1 включает белок raptor (regulatory associated protein of mTOR, регулирующий 
ассоциированный белок mTOR ); mLST 8 (mammalian lethal with Sec13 protein8, ), известный 
также  как  GβL  [1,2];  PRAS40  (proline-rich  AKT  substrate  40  kDa,  богатый  пролином  АКТ 
субстрат  40)  и  белок  deptor    (DEP-domain-containing  mTOR-interacting,  DEP  –домен 
содержащий  взаимодействующий  с  mTOR)  [3].  mTORC1  регулирует  клеточный  рост  и 
размер  клеток,  активируя  множество  анаболических  процессов,  включая  биосинтез  белков, 
липидов  и  органелл,  а  также  ограничивая  катаболические  процессы,  такие  как  аутофагия. 
Однако  бесспорно  то,  что  основной  функцией  mTORC1  комплекса  является  регуляция 
синтеза белка путем фосфорилирования 4E-BP1 и S6K1.  
В состав mTOR комплекса 2 (mTORC2)  входят mTOR, рапамицин- нечувствительный 
спутник  mTOR  -  rictor  (rapamycin  insensitive  companion  of  mTOR),  mLST8,  mSIN1 
(mammalian  stress-activated  protein  kinase  interacting  protein  ,  белок  взаимодействующий  со 
стресс-активируемой протеинкиназой 1 млекопитающих) [4],  protor 1 (protein observed with 
rictor-1, белок взаимодействующий с rictor-1) [5],  и deptor [3]. TORC2 играет ключевую роль 
в  различных  биологических  процессах,  включая  клеточный  метаболизм,  пролиферацию  и 
выживание клеток, организацию цитоскелета.  
Не  смотря  на  то,  что  за  последнее  десятилетие  в  области  исследования  mTOR 
сигнального  пути  были  получены  значительные  результаты,  наши  знания  остаются  не 
полными  и  существует  множество  вопросов,  требующих  своего  решения.  Одним  из  таких 
вопросов является разработка оптимальных методов выделения mTOR комплексов. 
Материалы и методы 
Клеточная культура 
В настоящей работе использовались клеточные линии HEK 293T, MDA-MB-435, PC3, 
HeLa.  Раковые  клеточные  линии  (HeLa,  MDA-MB-435)  получены  от  Американской 
коллекции  клеточных  культур  (ATCC,  Manassas,  VA).  Клетки  культивировались  в  среде 
DMEM  (Dulbecco’s  Modified  Eagle’s  Medium),  содержащей  10%    телячью  эмбриональную 
сыворотку  (FBS,  Atlanta  Biological),  2  mM  L-глутамин  (Thermo  scientific)  и  100  едн/мл 
пенициллин/стрептомицина (Thermo scientific) в атмосфере 5% CO2 при 37ºC.  
Антитела 
Проводили  тестирование  специфических  антител  (Abs)  с  целью  установления 
эффективности детекции компонентов  mTORC1 и mTORC2:  
a)
 
Антитела, производства Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) - mTOR (FRAP 
антитела  (козлинные,  #sc-1549,  IP);  rictor  антитела  (козлиные,  rictor  Ab,  #sc-50678,  вестерн 
блот, IP); вторичные HRP антитела  (вестерн блот). 
b)
 
Антитела, производства Cell Signaling (Danver, MA) - mTOR (кроличьи mTOR Ab, 
#2983,  Cell  Signaling,  вестерн  блот);  Raptor  (кроличьи,  #  cs  24C12);  S6K1(кроличьи,  #  cs 
24C12); pS6K1 T389 (кроличьи, # cs 24C12). 
c)
 
Антитела,  производства  Bethyl  (Montgomery,  TX)  -  raptor  (кроличьи  raptor  Ab, 
#A300-553A, вестерн блот и  IP) and  rictor (кроличьи rictor Ab, # A300-459A, вестерн блот и  
IP). 
d)
 
Антитела  мышиные  Sin1моноклональные  Ab    is  (#05-1044),  производства 
Millipore, Bedford, MA. 
Иммунопреципитация  (IP)  
Культуру клеток, предварительно промыв двухкратно 5 мл охлажденного  фосфатно-
солевого  буфера  (PBS)  (850  г.  NaCl,  115  г.  Na
2
HPO
4
,  20,3  г.  NaH
2
PO
4
  на  10  л.  дд.  H
2
O,  рH 

 
22 
7.2),  лизировали  с  использованием  лизисного  буфера  (40mM  Hepes,  100mM  NaCl,  1mM 
EDTA,  50  mM  NaF,  10  mM  пирофосфат  натрия,  10  mM  β  глицерофосфат  натрия), 
содержащего 0.3% Chaps и ингибиторы протеаз (Roche). 
В  супернатант,  полученный  после  центрифугирования  (12000xg,  12  мин,  t=  +4
0
C)  , 
добавляли  первичные  антитела  и  инкубировали  в  течение  2  часов  при  температуре  +4
0
C.  
Агарозные  гранулы  (Thermo  scientific),  предварительно  растворив  в  охлажденном  PBS  из 
расчета  1:1,  добавляли  в  количестве  45  µl  в  супернатант  после  2  часового  инкубирования 
последнего  с  антителами.  После  1часа  инкубации  агарозные  гранулы    осаждались 
центрифугированием  (5000xg,  1  мин,  =  +4
0
C)  и  промывались  троекратно  0.3%  Chaps 
лизисным  буфером.    Все  процедуры  во    время  проведения  иммунопреципитации 
проводились на льду, во избежание денатурации белков.  
Сильвер стейнинг 
Для 
сильвер 
стейнинга 
использовался 
SilverQuest 
Silver 
Staining 
Kit 
(Invitrogen).Полиакриламидный 
гель 
7.5% 
после 
электрофореза 
промывали 
дистиллированной водой и инкубировали в растворе фиксатора (40% этиловый  спирт, 10% 
уксусная  кислота)  в  течение  16  часов.  Затем  последовательно  промывали  в  30%    этиловом 
спирте, дистиллированной воде и растворами выше названного кита. 
Результаты и обсуждения 
Оптимизация  лизиса  клеток  или  тканей  вовремя  очистки  белковых  комплексов 
является необходимой для сохранения целостности выше названных комплексов. Однако это 
достаточно сложный процесс. Для того чтобы определить параметры, которые являлись бы 
наиболее оптимальными для данного комплекса белков, необходимо, прежде всего, изучить 
различные условия проведения лизиса клеток. Целостность белкового комплекса зависит от 
множества  условий,  как  то  концентрация  солей  в  лизисном  буфере,  pH,  наличие  или 
отсутствие  ионов  кальция  или  магния,  тип  и  концентрация  детергентов.  Все  выше 
перечисленное  является  ключевыми  факторами,  которые  необходимо  учитывать  во  время 
проведения очистки белкового комплекса.  
Так  как  в  наших  исследованиях  первоочередной  задачей  являлась  детекция 
молекулярной  массы  неизвестных  комплексов,  первоначальный  метод  исследования, 
который  мы  применили,  был  гель-фильтрация.  Различные  типы  раковых  клеток  человека 
лизировались  с  применением  стандартного  лизисного  буфера,  содержащего  либо 
стабилизирующий  цвиттерионный  детергент  –  CHAPS  (0.3%),  либо  неионный  детергент  - 
Triton  X-100    (1%).  Triton  X-100  широко  известен,  в  то  время  как  CHAPS  довольно  редко 
применяется и используется в основном только в экспериментах по изучению мембранных 
белков.  При  выборе  последнего,  мы  руководствовались  имеющейся  в  литературе 
информацией  о  довольно  успешном  применении  CHAPS  для  очистки  mTOR  из  тканей 
головного  мозга  крыс.  Последующее  фракционирование  клеточного  лизата,  содержащего 
0.3% CHAPS с использованием гель-фильтрации показало, что mTOR присутствует во всех 
фракциях.  К  сожалению,  мы  не  смогли  использовать  клеточные  лизаты,  полученные  с 
применением  Triton  X-100  для  последующего  фракционирования  в  связи  с  тем,  что  выше 
указанный детергент значительно повышал давление в колонке. Однако мы предположили, 
что  мультибелковый  комплекс,  включающий  mTOR  имеет  большую  молекулярную  массу 
вследствие  чего  возможно  его  осаждение  ультрацентрифугированием.  Поэтому  нами  была 
использована 
более 
упрощенная 
техника 
осаждения 
белкового 
комплекса 
– 
ультрацентрифугирование (Рис. 1А). 
Проведенные  исследования  позволили  нам  сделать  заключение,  что  искомый 
комплекс  находится  не  в  супернатанте,  а  в  осадке,  в  том  случае  если  мы  использовали 
клеточный  лизат,  полученный  с  применением  CHAPS  лизисного  буфера  (Рис.  1B). 
Интересным  является  тот  факт,  что  при  использовании  Triton  X-100  мы  могли  наблюдать 
совершенно противоположную картину. Это стало первой предпосылкой осознания того, что 
применение  именно  CHAPS,  но  не    Triton  X-100  для  лизиса  клеток  позволяет  сохранить 
целостность mTOR комплекса. Последующие наши исследования подтвердили эту догадку, 

 
23 
так как мы выяснили, что применение Triton X-100 приводит к коллапсу как mTORС1 так и 
mTORC2, вследствие нарушения белок-белковых взаимодействий между mTOR, раптором и 
риктором.  Важно  отметить,  что  при  использовании  CHAPS  подобного  эффекта  не 
наблюдалось  (Рис.  1C).  Только  формирование  комплекса  между  mTOR  и  mLST8  (GbL) 
можно  было  детектировать  при  использовании  обоих  детергентов  (Рис.  1C),  так  как  этот 
относительно  небольшой  по  своей  молекулярной  массе  белок  оказался  не  чувствителен  к 
действию Triton X-100.  
 
 
Каталог: repository -> repository2012
repository2012 -> Қыту ҥ рдісінде ақпараттық-коммуникациялық технологияны қолданудың Ӛ зектілігі
repository2012 -> Л. Н. Гумилев атындағы ЕҰу хабаршысы
repository2012 -> Ланның Қазақстаның тас дәуiрi ескерткiштерiн зерттеуi ермекбаева Аида Қайнар
repository2012 -> Г. Комантай, Б. З. Андасова, А.Ә. Шәріпбаев Қазақ мәтінін бір графикадан екінші графикаға түрлендіру
repository2012 -> ОҚушылардың логикалық ойлау қабілетін дамыту уақыт талабы
repository2012 -> 1986 жылғы желтоқсан оқИҒасына қатысты шетелдік әдебиеттердегі тарихи т ҧ жырымдамалар
repository2012 -> Әож 314(100-574) шетелдегі қазақ диаспорасының Қазіргі жағдайы
repository2012 -> Қазақстандағы адам және азаматтардың саяси қҦҚЫҚтарын қОРҒаудың Ӛзекті мәселелері
repository2012 -> М. М. Илипов, С. К. Атанов Интеллектуальные смарт-карты – история и перспективы


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   31


©emirsaba.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет