Актуальность проблемы сальмонеллезов связанна с высокими уровнями заболеваемости и длительно сохраняющейся тенденцией к ее росту, трудностями в эпидемиологическом расследовании причин сальмонеллезов

Слизень В.В., Гудкова Е.И., Скороход Г.А. Разработка метода пцр для экспресс- 
идентификации Salmonella spp. И среди них Salmonella enteritidis// Сборник научных тру-
дов «Инновации в медицине», Минск, БГМУ, 2012 – 6 С.  
 
 
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПЦР ДЛЯ ЭКСПРЕСС- ИДЕНТИФИКАЦИИ
SALMONELLA SPP. И СРЕДИ НИХ SALMONELLA ENTERITIDIS 
 
Слизень В.В., Гудкова Е.И., Скороход Г.А. 
Белорусский государственный медицинский университет 
 
Актуальность проблемы сальмонеллезов связана с высокими уровнями заболевае-
мости и сохраняющейся тенденцией к ее росту, трудностями в эпидемиологическом рас-
следовании причин сальмонеллезов, формированием резистентности к противомикроб-
ным препаратам, отсутствием эффективной специфической профилактики. Разработка ме-
тодов экспресс-диагностики сальмонеллезов и методов типирования сальмонелл является 
одним из важных моментов сдерживания распространения возбудителей [1].
Цель исследования – разработать метод генетической экспресс-идентификации 
сальмонелл. 
Материалы и методы.
Разработка праймеров и TaqMan зондов. Из GenBank, 
NCBI (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
или 
http://www.xbase.ac.uk
) были получены сиквенсы 
гена invA для разных серовариантов сальмонелл (код доступа NC_011294.1, GenBalnk, NCBI 
Salmonella typhimurium (рис.1)).
Рисунок 1 − Структура локуса в 20000 п.о. Salmonella typhimurium, несущего invA ген 
С помощью программы Mega 5 проводили выравнивание сиквенсов 
invA гена, выби-
рали 
идентичные у всех серовариантов сальмонелл фрагменты, локализующиеся в первой 
половине гена. В процесс разработки олигонуклеотидов их последовательности генериро-
вали in silico с помощью программы http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ или 
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm, проверку специфичности праймеров и зондов 
проводили с использованием web-ресурса 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
. 

Оценку конформации шпилечных структур, образуемых праймерами и зондами, силу их 
связей и температуру плавления осуществляли с использованием web-ресурсов 
http://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Quickfold, 
http://www.atdbio.com/tools/oligo-
calculator. Расчет образования гетеро- и аутодимеров и энергию их связи проводили с ис-
пользованием 
программы 
«OligoAnalyzer» 
(http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/). Место отжига праймеров и зон-
дов проверяли с помощью программы http://bioinformatics.org/seqext/.
ПЦР. Экстракцию бактериальной ДНК проводили кипячением (10 минут) одной 
бактериальной петли 16 – 20 часовой чистой культуры сальмонелл в 100 мкл 5% Chelex-
100 в 1хТАЕ буфере, после чего центрифугировали при 14000 об./мин в течение 10 минут. 
Экстракт ДНК в количестве 10 мкл вносили в 40 мкл мультипраймерной ПЦР-смеси, 
содержащей из расчета на одну реакцию: а)10хПЦР буфера − 7 мкл; б) 3 мМ MgCl
2
; в) рас-
твор нуклеотидов (2 мМ) – 7 мкл; г) Taq-полимеразу - 2 ед; д) праймеры прямые и обрат-
ные для генов invA и sefA − по 20 пкмоль каждого; е) зонды, специфичные для invA и
sefA гена, − по 10 пкмоль; ж) присадки, улучшающие ход реакции; з) деионизованную во-
ду − add 40 мкл.
Амплификацию осуществляли c использованием следующего режима: 94 

С – 4 
мин, 45 циклов (95 

С – 30 с, 60

С – 70 с). Детекцию флюоресценции проводили после 
каждой стадии отжига на каналах FAM и JOE. Верификацию образования ПЦР продуктов 
осуществляли электрофорезом 14 мкл образцов в 2% агарозном геле с бромидом этидия 
(0.5 мкг/мл); параметры электрофореза − 200 В, 100 мА, 1 час.
Для проведения ПЦР, позволяющей выявлять сальмонеллы и среди них S. enter-
itidis, были использованы праймеры и зонды, приведенные в таблице 1.
Таблица 1 − Использованные праймеры и зонды для идентификации сальмонелл и
среди них S. enteritidis 
Ген 
Праймеры и зонды 
Размер, п.о. 
Признак 
SEFA-1
GGCTTCGGTATCTGGTGGTGTG 
97 
Выявление S. enteritidis 
по специфическим для 
них маркеру 
SEFA-2 
GTCATTAATATTGGCTCCCTGAATA 
Флюоресцирую-
щий зонд SEFA 
CCACTGTCCCGTTCGTTGATGGACA
Inv-1 
TGTCGTCATTCCATTACCTACC 
288 п.о. Выявление специфиче-
ского маркера для рода 
сальмонелл 
Inv-2 
ACGGTGACAATAGAGAAGACAAC 
Флюоресцирую-
щий зонд INVA 
TCTGGTTGATTTCCTGATCGCA