Актуальность проблемы сальмонеллезов связанна с высокими уровнями заболеваемости и длительно сохраняющейся тенденцией к ее росту, трудностями в эпидемиологическом расследовании причин сальмонеллезов
Результаты исследований и их обсуждение
жүктеу/скачать 379,94 Kb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- А) Для праймеров.
- Для реакционной смеси.
| Результаты исследований и их обсуждение. В качестве генетических маркеров
сальмонелл могут выступать различные гены. Ряд исследователей используют метод идентификации S.enteritidis по их генетическому маркеру − гену spvA, локализованному на большой плазмиде вирулентности, имеющейся у 80% изолятов сальмонелл. [2, 3]. Опубликованы несколько сообщений о применении метода ПЦР для выявления сальмо- нелл по гену invA, необходимому для инвазии [4, 5]. Ряд исследователей использовали для идентификации сальмонелл видоспецифический фрагмент гена fimA, кодирующий основ- ную субъединицу фимбрий, который присутствует у всех представителей рода сальмо- нелл и даже у не имеющих жгутиков представителей, таких как S.pullorum [6]. Ряд иссле- дователей используют детекцию гена sefA для идентификации сероваров: S.enteritidis, S.pullorum и S.gallinarum [6]. В связи с тем, что специфичность ПЦР реакции зависит от свойств используемых праймеров и зондов, для дизайна зондов и праймеров для invA и sefA гена были разработа- ны следующие критерии: А) Для праймеров. Температура плавления (Tm) у обоих праймеров должна быть идентичной и составлять 58-60 о С, при этом температура плавления зонда должна быть на 5 − 10 о C выше, чем праймеров. Содержание G+C должно варьировать в пределах 30 − 80%. Более высокое содержание G+C требует использование присадок (глицерола, ДМСО, 7-деаза-ГТФ, бетаина, трегалозы, твина, бычьего сывороточного альбумина), сни- жающих температуру плавления. В праймерах не должно быть более четырех повторяю- щихся подряд однотипных нуклеотидов. Общее количество остатков гуанина и цитозина в пяти последних нуклеотидах на 3’ конце праймера не должно превышать 2. На 3' конце предпочтительно располагать аденин, что позволяет образуемым димерам легко разру- шаться. Максимальный размер образуемого в ПЦР ампликона должен быть не более 400 п.о., при этом идеальный размер составляет 50 − 150 оснований. Б) Для зондов. В зонде не должно содержаться тандема из четырех или более од- нотипных нуклеотидов, содержание GC должно варьировать в пределах 30 − 80%, при этом должно быть больше гуанина, чем цитозина. Зонд не должен заканчиваться на 5' конце гуанином, который может вызывать гашение флюоресценции FAM. В случае обра- зования вторичной шпильки на 3’ конце, рассчитанная энергия внутренних связей ее не должна превышать «-2ккал», в случае образования шпильки внутри олигонуклеотида − не более «-3 ккал». В случае образования аутодимеров, их энергия взаимодействия не долж- на превышать на 3’ конце − «- 5ккал», внутри − «-6 ккал». Рассчитанная энергия взаимо- действия гетеродимеров по 3’ концам должна быть не более «-5ккал», внутри – не более «- 6 ккал». В) Для реакционной смеси. В реакционной ПЦР-смеси концентрация MgCl 2 должна быть 4-7 мМ (в среднем – 5,5 мМ), концентрация нуклеотидов − 200 мM каждого. Оптимальная концентрация пробы − 50 − 200 нM, концентрация праймеров 100 − 900 нM. Праймер, амплифицирующий цепь, к которой приваривается зонд, должен быть взят в концентрации в два раза большей, чем другой праймер. Использование этих критериев позволяет разработать праймеры и зонды, обеспе- чивающие высокие уровни специфической флюоресценции. Оценку возможности выявления сальмонелл по invA гену, а S. enteritidis по sefA гену осуществляли сначала в ПЦР, а потом в ПЦР в реальном времени. В процессе постановки мультиплексной ПЦР-реакции с применением праймеров, специфичных для генов invA и sefA, образуются различные профили фрагментов, в зави- симости от сероварианта сальмонелл. В случае присутствия в образце S. enteritidis образуют- ся два фрагмента размером 100 и 288 п.о. Если в пробе присутствуют сальмонеллы других серова- риантов, то образуется один ампликон, размером 288 п.о., в случае присутствия генетического материала E. coli или S. aureus ПЦР-продукты не выявляются (рис. 2). Сальмонеллы различных серовариантов − S. derby; S. tythimurium, S. infantis, S. agama, S. london, S. brandenburg, S. virchow, S.enteritidis − образуют ампликоны размером 288 п.о, что позволяет использовать разработанные праймеры для специфической детекции сальмонелл по маркерному для них гену invA, а S. enteritidis по гену sefA . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1, 10 − S. tythimurium, 2,3,4,5 − S. enteritidis, 6 − E. coli, 7 − S. aureus, 9 − S. london, 11 − маркер молекулярного веса ДНК 50 bp Рисунок 2 – Результаты амплификации sefA и invA гена. В положительных случаях обра- зуются ампликоны 100 п.о. и 288 п.о. соответственно В последние годы в диагностическую практику внедряются молекулярно- биологические методы диагностики, в частности полимеразная цепная реакция в реальном времени, которая существенно повышает чувствительность исследования и снижает время детекции возбудителя, в связи с отсутствием стадии электрофореза [4 − 6]. Нами была оценена способность разработанных флюоресцирующих зондов к invA и sefA генам дис- криминировать S. enteritidis среди остальных серовариантов сальмонелл. В процессе про- ведения ПЦР в реальном времени в случае присутствия в пробе S. enteritidis, флюоресцен- ция выше пороговой отмечается на двух каналах FAM и JOE, при этом формирующие кривые флюоресценции имеют специфическую форму, уровни флюоресценции достигают порогового уровня на 15 − 20 цикле и регистрируемая конечная флюоресценция на 35 цикле составляет 4000 − 6000 RFU (рис. 3 А). В случае присутствия сальмонелл других серовариантов (S. derby; S. tythimurium, S. infantis, S. agama, S. london, S. brandenburg, S. virchow, S.enteritidis), флюоресценция регистрируется только на канале FAM, при этом флюоресценция на канале JOE ниже пороговой (рис. 3Б). Контроли, которые не содержат ДНК, либо содержат ДНК иных микроорганизмов, чем сальмонеллы, характеризуются от- сутствием флюоресценции выше пороговой на обоих каналах. жүктеу/скачать 379,94 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|