Бегенова Айнагуль Байболсыновна фармацевтическая биотехнеология для студентов технических специальностей 5В070100 «Биотехнология» Нур-Султан 2021 г рабочая программа дисциплины

Препараты на основе МКА получили широкое распространение в иммунотерапии и иммунодиагностике злокачественных заболеваний. Уже сегодня без препаратов на основе МКА немыслима диагностика злокачественных заболеваний крови, определение иммунологического статуса пациентов, контроль за эффективностью лечения. Антитела, узнающие опухолеспецифичные антигены, могут использоваться для идентификации опухолевых клеток в различных образцах, включая образцы биопсии.

Традиционный метод производства МКА – это метод in vivo, представляющий собой введение мышам или крысам гибридомных клеток выбранного клона с последующим развитием опухолевых асцитов и отбором асцитной жидкости. Однако этот метод обладает рядом значительных недостатков. Во-первых, от мыши можно получить до 50 мг целевого продукта, что не удовлетворяет потребность в препаратах на основе моноклональных антител. Во-вторых, производство in vitro позволяет обеспечить контроль производства, стандартизацию, а также имеет важные преимущества над производством в условиях in vivo в отношении вирусной безопасности, постоянства производства и отсутствия контаминирующих иммуноглобулинов в неочищенных сборах. Другие преимущества этого метода производства заключаются в использовании культуральных сред без сыворотки, а также в значительном сокращении использования животных. Исходя из этих соображений, способ производства in vitro является предпочтительным, и производство in vivo допускается только в определенных обстоятельствах и должно быть обосновано.

Существуют два подхода к культивированию животных клеток in vitro. Первый подход основан на иммобилизации и включении клеток в твердую матрицу. Второй подход включает культивирование клеток в гомогенной суспензии. Выбор одного из этих двух методов получения моноклональных антител в основном определяется требованиями производственного процесса.

Тем не менее, культивирование клеток в гомогенной суспензии имеет ряд преимуществ: это довольно простой и легкий в управлении метод. Он обладает высокой воспроизводимостью, а значит, высокими потенциальными возможностями для производства высококачественной продукции. Система получения моноклональных антител в гомогенной суспензии способна работать асептически в течение длительного времени, а также просто и эффективно масштабируется. Кроме того, при проведении процесса в суспензии за счет перемешивания достигается высокая гомогенность культуры.

Процесс иммунизации проводится с целью формирования иммунного ответа и запуска выраженного антителообразования. Дополнительной задачей является перевод их в такое функциональное состояние, при котором они способны будут образовывать антителопродуцирующие гибридные клетки. Обычно для этого используют мышей или крыс, которых иммунизируют очищенными антигенами. Большое значение имеет то, насколько эффективно проходит процесс иммунизации. Его успех определяется рядом факторов, в том числе свойствами иммуногена, сочетанием с адъювантами, подбором оптимальной схемы иммунизации.

Параллельно с этим происходит культивирование миеломы. Клетки миеломы – это злокачественные трансформированные лимфоидные клетки костного мозга, которые способны синтезировать моноклональные антитела определенной специфичности и обладают способностью к неограниченному размножению in vivo и in vitro.

Плазмоцитомы обладают слабой способностью к росту вне организма. Для поддержания культуры клеток используются различные ростовые факторы, источником которых могут быть перитонеальные макрофаги, спленоциты или сыворотка крови мышей, иммунизированных полным адъювантом Фрейнда.

Гибридизацию лимфобластов и плазмоцитомы проводят путем клеточного слияния, опосредованного различными агентами, приводящими к изменению мембран клеток, формированию цитоплазматических контактов и формированию дикарионов. В качестве индуктора слияния клеток в современных работах используется полиэтиленгликоль (ПЭГ). Он вызывает перераспределение мембранных белков, обеспечивая контакт и слияние клеток за счет ионов кальция, приводящих к образованию кальциевых каналов между клетками. Более современный способ индукции слияния клеток состоит в использовании воздействия электрических импульсов, в результате чего получают несколько типов дикарионов.

Для отбора гибридных клеток используется среда НАТ, содержащая аминоптерин, а также гипоксантин и тимидин, опосредующие альтернативный путь синтеза ДНК. В результате селекции выживают только дикарионы, возникшие в результате слияния двух лимфобластов или лимфобласта и плазмоцитомы. Первые быстро погибают ввиду ограниченного пролиферативного потенциала, а целевые гибридные клетки выживают.

Обнаруженные гибридомные клоны должны быть немедленно реклонированы, т.к. после слияния во многих гибридах начинается «выброс» хромосом и в ходе этого некоторые клетки могут потерять хромосомы, несущие гены синтеза иммуноглобулинов. Существует несколько способов клонирования гибридом. При методе предельных разведений клетки отбирают из тех лунок, в которых обнаружены антитела нужной специфичности, ресуспендируют и затем разводят таким образом, чтобы при последующем разливе в каждую лунку планшета попала бы только одна клетка и формировался только один клон гибридом.

Следующим этапом является скрининг гибридов-продуцентов. Наиболее распространенными методами являются методы иммуноанализа на основе ферментных и флуоресцентных меток.

После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие антитела, приступают к их массовому наращиванию, результатом чего является подготовка инокулята.

Накопление целевого продукта происходит в результате ферментации. Наиболее эффективным подходом является культивирование в гомогенной суспензии. Для культивирования могут использоваться бессывороточные среды, например, среда на основе RDF. Примером среды, включающей сыворотку, может быть RPМI 1640. Однако в современных работах чаще всего используются бессывороточные среды. При этом культивирование проводят при температуре около 37 ^оС в присутствии СО₂. Очень важно эффективное перемешивание, так как при культивировании необходимо равномерное распределение клеток по всему объему сосуда. Процесс ферментация аэробный, производится полунепрерывным способом с подпиткой при активной подаче воздуха.

При культивировании клеток целевой продукт секретируется в культуральную жидкость, поэтому необходимо удаление биомассы, это осуществляется в процессе центрифугирования. После отделения биомассы, культуральная жидкость фильтруется через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм и временно помещается в хранилище для дальнейшей обработки. В процессе фильтрации осуществляется полное удаление оставшихся клеток, а также снижение объема жидкости с целью облегчения хромотографии. Может потребоваться несколько следующих друг за другом этапов фильтрации для достижения этих целей.

От области применения антител зависит необходимая степень очистки. Для диагностических целей достаточно иметь препараты антител 70-95% степени чистоты. С другой стороны, при применении антител в иммунотерапии их чистота должна быть выше. Очистка осуществляется в следующих друг за другом стадиях аффинной и ионно-обменной хроматографии. В качестве ионнообменника для выделения антител чаще всего используют диэтиламиноэтил, прикрепленный к целлюлозе, сефарозе или акриламидным гранулам. В аффинной хроматографии для очистки используют прикрепленные к носителю антигены.

Вирусная инактивация осуществляется с целью обеззараживания вирусов и бактерий, находящихся в культуральной жидкости.

Следующий этап производства имеет своей целью удаление оставшихся примесей и повышение объемной концентрации целевого продукта. Для этого применяется гель-фильтрация на колонках с агарозой, сефарозой или сефадексом.