155
Экстракционный метод требует большого количества ценных
пищевых продуктов: из 1 кг мышц минтая получают всего 25 мг АТФ,
40 мг АДФ и 35 мг АМФ.
Химический синтез сложен, но некоторые синтетические нуклео-
зиды коммерчески доступны. Например, химическим аминированием
инозина (рибоксина) получают аденозин. Разработан
метод фермента-
тивного синтеза нуклеозидов с помощью фермента нуклеозидфосфо-
рилаза, образующего N-гликозидную связь между азотистым основа-
нием и пентозным остатком.
Перспективен микробиологический способ синтеза нуклеозидов.
Например,
Bacillus subtilis синтезирует 12–13 г/л инозина (рибоксина);
получен мутантный штамм
Bacillus subtilis 556, образующий до 55 г/л
инозина. Бактерии
Bacillus pumilus способны накапливать в среде
29,6 г/л инозина и/или 4,2 г/л гуанозина. В Японии получен мутант-
ный штамм
Bacillus subtilis, накапливающий 10,4 г/л цитидина в куль-
туральной жидкости.
Самым технологичным и доступным методом промышленного по-
лучения всех четырех нуклеозидов риборяда является гидролиз РНК.
Технические препараты РНК производят из
дрожжевой массы.
Основная задача при этом – достичь высокого выхода РНК (85–90%
от РНК, содержащейся в клетках дрожжей) при высоком содержании
основного вещества в техническом препарате (не менее 75%).
Существуют различные методы выделения РНК из дрожжевой мас-
сы, но наиболее экономичным считают процесс экстракции РНК 10–
12%-ным раствором NaCl в щелочной среде при температуре 85–90°С.
Процессуальная схема получения технической РНК представлена
на рис. 15.1.
Гидролиз РНК осуществляют различными методами:
– ферментативный гидролиз с использованием иммобилизован-
ных нуклеаз или интактного мицелия штамма
Spicaria violacea;
– кислотный гидролиз;
– щелочной гидролиз.
Из
ферментативных методов наиболее отработано применение
мицелия гриба
Spicaria violacea.
Полнота гидролиза РНК в этом мето-
де достигает 80%. Однако получение мицелия
Spicaria violacea
направленным культивированием гриба с содержанием требуемого
набора РНК-гидролизующих ферментов в достаточном количестве яв-
ляется дорогостоящим и труднорегулируемым процессом. Фермент-
ный состав мицелия сильно зависит даже от незначительных измене-
ний условий культивирования.
157
Кислотный гидролиз РНК в мягких условиях (рН 4) приводит
к получению сложной смеси из-за сопутствующего разрыва гликозид-
ной связи в пуриновых нуклеотидах. Гидролиз формиатом аммония
осуществляют в жестких условиях (230°С). В щелочной среде образу-
ется смесь нуклеотидов, нуклеозидов и олигонуклеотидов.
В
качестве гидролизующих агентов целесообразно использовать
соединения, образующие с ионами РО
4
3
нерастворимый осадок. Этим
требованиям отвечают соединения кальция и магния. Разработан про-
цесс гидролиза РНК в присутствии гидроксида свинца (НПО «Био-
лар», Латвия), но практическое применение метода ограничено серь-
езными недостатками процесса: экологическими
проблемами с отхо-
дами, содержащими свинец, и присутствием в препаратах остатков
соединений свинца.
Наиболее приемлема разработанная в Республике Беларусь техно-
логия гидролиза РНК оксидом кальция. Процесс гидролиза осуществ-
ляют при температуре 130–135°С, давлении 0,2–0,3 МПа в течение 3 ч.
В этих условиях РНК гидролизуется на 80–90%. При гидролизе обра-
зуется фосфат кальция, который выпадает в осадок и легко отделяется
фильтрованием.
Из числа нуклеозидов гидролизата наименее растворим в воде гуа-
нозин. Он выпадает в осадок даже из теплых окрашенных гидролиза-
тов без дополнительной обработки. При охлаждении гидролизата гуа-
нозин кристаллизуется. Содержание основного вещества в кристаллах
составляет 80–85%. Для получения продукта высокой чистоты техни-
ческий гуанозин подвергают перекристаллизации с очисткой активи-
рованным углем. Обработку углем осуществляют при температуре
80–90°С. После отделения угля раствор охлаждают до комнатной
температуры и кристаллизуют в течение 48 ч. Кристаллы отделяют
фильтрованием через капроновую ткань, промывают дистиллирован-
ной водой и этанолом и сушат при 40–50°С (рис. 15.2).
Гидролизат после выделения гуанозина концентрируют упари-
ванием при 70°С под разрежением и разделяют нуклеозиды ионооб-
менной хроматографией на сильноосновном анионите АВ-17-2М
в ОН
–
-форме. Для элюирования нуклеозидов используют дистилли-
рованную воду, растворы слабых кислот. Цитидин выделяют, ис-
пользуя в
качестве элюента дистиллированную воду. Цитидиновую
фракцию упаривают под разрежением (70°С), очищают активиро-
ванным углем (50% угля от массы цитидина) при температуре 95–
100°С. После отделения угля раствор упаривают (70°С), в концентрат
158
добавляют этанол и кристаллизуют при 4–6°С в течение 48 ч. Кри-
сталлы сушат при 40–50°С.
Рис. 15.2. Процессуальная технологическая схема
получения препаратов индивидуальных рибонуклеозидов
Гидролиз
пасты
технической
РНК
Достарыңызбен бөлісу: