О книге Special for Dabl-v aka Эукариот Фрида Карловна Черкес, Лина Борисовна Богоявленская, Наталья Александровна Бельская – Микробиология


Титрование фага по Грация (на плотной среде) методом агаровых



Pdf көрінісі
бет66/305
Дата20.12.2022
өлшемі14,39 Mb.
#58441
түріУчебник
1   ...   62   63   64   65   66   67   68   69   ...   305
Байланысты:
8dccb36

Титрование фага по Грация (на плотной среде) методом агаровых 
слоев позволяет определить количество частиц фага в титруемом материале. 
Метод основан на том, что каждая частица фага дает зону просветления 
(лизиса) на чашке с газоном чувствительного к нему микроба, т. е. образует 
отдельную колонию. 
Постановка опыта. Чашки с 20-25 мл МПА покрывают стерильной 
фильтровальной бумагой и подсушивают в термостате или под бактерицидной 
лампой (расстояние от лампы не более 2 м). Титруемый фаг разводят от 10
-1
до 
10
-10
(как в предыдущем опыте) и по 1 мл переносят в другие пронумерованные 
пробирки (соответственно из 1-й в 1-ю и так далее до 10-й), в которые заранее 
наливают по 2,5 мл 0,7% МПА, расплавленного и остуженного до 45° С. В 
каждую из этих пробирок добавляют по 0,1 мл тест-культуры. Содержимое 
пробирок быстро перемешивают (не дать застыть агару) и выливают на 
поверхность среды в чашки Петри с номерами, соответствующими номерам 
пробирок. Через 30 мин чашки ставят в термостат. 
Учет результатов проводят через 18-20 ч. При большой концентрации фага 
(в первых чашках) произойдет сплошной лизис культуры. В тех разведениях 
фага, в которых находилось небольшое количество частиц фага, появятся 
изолированные колонии, которые подсчитывают. Чтобы не ошибиться в счете, 
каждую учтенную колонию помечают со стороны дна чашки. Аппарат для 
счета колоний намного облегчает работу (см. рис. 54). Чтобы установить 
количество частиц фага в 1 мл фаголизата, пользуются формулой: n = y×x, где 
n - 
искомое число; y - количество выросших на чашке колоний фага; x - 
разведение фага в чашке, в которой подсчитаны колонии. 
Например, если в чашке с разведением фага 10
-8
(1:10
8
) выросло 25 колоний, 
то в 1 мл исходной жидкости содержится 25×10
8
или 2,5×10
9
частиц фага. 
Более точные результаты получают, если определяют количество частиц 
фага в исходной жидкости по нескольким разведениям и вычисляют среднее 
арифметическое. Например, при разведении фага 10
-6
выросло 320 колоний, 
следовательно, в 1 мл исходной жидкости было 320×10 или 3,2×10
8
частиц 
фага. При разведении фага 10
-7
выросло 42 колонии, следовательно, в исходной 
жидкости было 4,2×10
8
/мл частиц фага. При разведении фага 10
-8
выросло 5 
колоний, следовательно, в исходной жидкости было 5×10
8
/мл частиц фага. 
Сложив величины, полученные при этих подсчетах и разделив сумму на 3 
(количество проведенных подсчетов), устанавливают число частиц фага в 1 мл 
титруемого препарата. В нашем примере оно равно 4,1×10
8



Подсчитывать колонии лучше всего на чашках, где выросло не меньше 5 и 
не больше 50 колоний. В противном случае страдает точность подсчёта. Если 
на чашке много колоний, чашку можно разделить на несколько секторов, 
сосчитать колонии на одном из них и полученную цифру умножить на 
количество секторов. 
Как правило, все биологические исследования проводят в трех 
параллельных опытах. В данном примере каждое разведение фага 
одновременно титруют трижды. 
Методы выделения фагов 
Прямой метод. Фаг получают и изучают непосредственно в фильтратах 
исследуемого материала. О наличии и активности фага узнают по лизису 
чувствительной к нему культуры. 
Как правило, прямой метод не дает убедительных результатов из-за малого 
количества содержащегося в фильтрате фага. Для повышения его количества 
используют методы обогащения


Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   62   63   64   65   66   67   68   69   ...   305




©emirsaba.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет