О книге Special for Dabl-v aka Эукариот Фрида Карловна Черкес, Лина Борисовна Богоявленская, Наталья Александровна Бельская – Микробиология
Титрование фага по Аппельману (в жидкой среде)
жүктеу/скачать 14,39 Mb. Pdf көрінісі
|
| Титрование фага по Аппельману (в жидкой среде). При титровании фага
объем и состав среды, температура, аэрация, количество микробов, пробирки, в которых проводят титрование (диаметр, конфигурация дна, толщина стекла), должны быть одинаковыми. Изменяется только количество фага. Все компоненты, участвующие в биологических опытах, подлежат обязательному контролю на правильность их работы. При титровании фага ставят контроль фага и бульона на стерильность, контроль культуры - на ее жизнеспособность. Постановка опыта. 1. В 12 стерильных пробирок наливают по 4,5 мл стерильного бульона. Уровень жидкости во всех пробирках должен быть одинаковым. Если это не так, значит допущена ошибка. В этом случае нестандартную пробирку заменяют новой и заново наполняют бульоном. При разливе бульона пользуются пипетками вместимостью 5-10 мл. 2. Пробирки ставят в штатив и нумеруют от 1 до 10, на одной из оставшихся пробирок пишут "КК" (контроль культуры), на другой - "КФ" (контроль фага). Все пробирки, в которых проводят опыт, должны быть надписаны. 3. В десяти пробирках готовят последовательные десятикратные разведения фага от 10 -1 до 10 -10 (табл. 9). В 1-ю пробирку вносят 0,5 мл фага. Такое же количество вносят в пробирку контроля фага. Сменив пипетку, новой пипеткой тщательно перемешивают содержимое 1-й пробирки и переносят 0,5 мл его во 2-ю пробирку; 0,5 мл содержимого 2-й пробирки переносят в 3-ю и так далее до 10-й пробирки, меняя каждый раз пипетки. Перемешав содержимое 10-й пробирки, 0,5 мл жидкости из нее выливают в дезинфицирующий раствор. Также поступают с содержимым пробирки контроля фага. Для разведения фага пользуются пипетками вместимостью 1-2 мл. Проверяют уровень жидкости в пробирках. Он должен быть одинаковым. Таблица 9. Схема титрования фага по Аппельману Условные обозначения: + рост культуры, - отсутствие роста культуры. Примечание. Стрелки указывают перенос фага из пробирки в пробирку. Из пробирки 10 и из пробирки контроля фага 0,5 мл выливают в дезинфецирующий раствор. 4. Во все пробирки, кроме пробирки контроля фага, вносят по 1 капле (0,05 мл) взвеси тест-культуры. Пробирки встряхивают. Во всех пробирках, кроме пробирки контроля фага, должна появиться слегка заметная муть. Если этого не происходит, все операции с нестандартной пробиркой повторяют вновь. 5. Пробирки помещают в термостат на 18-20 ч, после чего учитывают результат титрования. Учет результатов обязательно начинают с контролей. При правильной постановке опыта в контроле культуры должно быть размножение бактерий - содержимое пробирки становится мутным. Этот контроль позволяет сделать вывод, что взятая в опыт культура жизнеспособна и что питательная среда обеспечивает ее развитие в данных условиях опыта. Значит, если в пробирках с фагом культура не выросла, на нее подействовал фаг. Жидкость в пробирке с контролем фага должна остаться прозрачной. Этот контроль позволяет сделать вывод, что посуда, бульон и фаг стерильны. При правильных результатах в контролях регистрируют характер изменений в первых десяти пробирках. Рост культуры в пробирках "опытного" ряда говорит об отсутствии или недостаточном количестве в них фага. Устанавливают титр фага, т. е. его наибольшее разведение, в котором произошел лизис культуры (содержимое пробирки прозрачно). Обозначают титр степенью разведения фага с обратным знаком, что соответствует порядковому номеру пробирки. Например, если культура не растет в первых семи пробирках, титр фага равен 10 -7 (см. табл. 9). жүктеу/скачать 14,39 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|