Решением Учебно-методического совета фгбоу дпо рманпо минздрава России «28» ноября 2016г


Измерение скорости изменения абсорбции



Pdf көрінісі
бет77/412
Дата07.12.2022
өлшемі4,09 Mb.
#55498
түріРешение
1   ...   73   74   75   76   77   78   79   80   ...   412
Байланысты:
e6b070e24f4686904d2cdeb41279e63c

Измерение скорости изменения абсорбции. В клинической биохимии 
фотометрические 
измерения 
в 
большинстве 
случаев 
проводятся 
непосредственно при протекании биохимических реакций, в процессе 
которых потребляются субстраты, повышаются продукты реакций или 
меняются ко-факторы реакций.
Тест Варбурга (УФ-тест) является одним из самых распространенным 
оптических тестов. Тест Варбурга основан на том, что один из продуктов 
дегидрогеназной 
реакции 
– 
восстановленная 
форма 
никотинамидадениндинуклеотид или его фосфат (НАДН или НАДФН) – 
имеет максимум поглощения при длине волны 340 нм, а их окисленные 
формы при этой длине волны практически не поглощают (рис. 2.5). УФ-тест 
Абсо
рбц
ия
в р е м я 
буфер 
реактив
проба 
Конечная точка 
Бланк по рабочему 
раствору 

А = А
общ
 – А
бланка
 
Бланк по кювете 


113 
может быть использован для определения скоростей тех реакций, в которых 
не участвуют НАД или НАДФ, но образующиеся продукты в сопряженных 
ферментативных 
реакциях 
приводят 
к 
окислению 
НАДН 
или 
восстановлению НАД (непрямой оптический тест Варбурга). 
Таблица 2.1 
Рабочая таблица для определения концентрации аналита методом 
измерения с бланком по рабочему реактиву 
 
 
Бланк 
Стандарт 
Проба 
Рабочий раствор 
1 мл 
1 мл 
1 мл 
Дистиллированная вода 
10 мкл 
– 
– 
Стандарт 
– 
10 мкл 
– 
Проба 
– 
– 
10 мкл 
Перемешать, измерить оптическую плотность через 5 мин инкубации 
Содержание аналита в пробе (
пробы
С
) рассчитывается по соотношению 
бланка
стандарта
бланка
пробы
пробы
А
А
А
А
С



Рис. 2.5. Спектры поглощения НАД
+
и НАД

Н. Восстановление НАД
+
до НАД

Н 
прослеживается при 340 нм – при этой длине волны имеется максимум поглощения 
НАД

Н, а НАД
+
не поглощает свет 
При кинетическом определении вычисляют изменение экстинкции за 1 
мин и рассчитывают активность по формуле: 
мин
E
v
l
V
A







1000
, где А – 
активность фермента, измеряемая в международных единицах (МЕ или Ед 
или U), определяется как количество фермента, которое катализирует 
превращение 1 микромоля (мкмоль) субстрата в 1 минуту. Каталитическая 


114 
активность фермента выражается числом единиц, рассчитанных для 1 литра 
биологической жидкости (Ед/л). 
V – объем реакционной смеси, мл;
1000 – коэффициент перерасчета на 1 л сыворотки; 

– коэффициент миллимолярной экстинкции НАДН в реакции 
6,22 л/(ммоль 

см); 
l – длина оптического пути (1 см); 
v – объем пробы (сыворотки крови или другого материала), мл; 

E – изменение экстинции за 1 мин. 
Результат арифметических вычислений для первой дроби формулы 
является фактором (F). Значение фактора вводится в программу фотометра 
или биохимического анализатора, в результате активность фермента 
рассчитывают следующим образом: 
мин
E
F
A
/



. При определении 
активности ферментов с использованием диагностических наборов известен 
используемый хромоген (следовательно, известен его коэффициент молярной 
экстинкции), установлены объем реакционной среды и объем образца, 
измерение проводится в кювете с длиной оптического пути 1 см. Поэтому 
расчет активности фермента проводится по фактору (F), умноженному на 

E/мин. Фактор приводится в инструкциях для разных температур 
инкубации. В современных программируемых фотометрах и биохимических 
анализаторах все расчеты программируются, и результаты получаются в 
конечном виде. 


Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   73   74   75   76   77   78   79   80   ...   412




©emirsaba.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет