Решением Учебно-методического совета фгбоу дпо рманпо минздрава России «28» ноября 2016г
Измерение скорости изменения абсорбции
жүктеу/скачать 4,09 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Конечная точка Бланк по рабочему раствору А = А общ – А бланка
- Рабочая таблица для определения концентрации аналита методом измерения с бланком по рабочему реактиву Бланк Стандарт
| Измерение скорости изменения абсорбции. В клинической биохимии
фотометрические измерения в большинстве случаев проводятся непосредственно при протекании биохимических реакций, в процессе которых потребляются субстраты, повышаются продукты реакций или меняются ко-факторы реакций. Тест Варбурга (УФ-тест) является одним из самых распространенным оптических тестов. Тест Варбурга основан на том, что один из продуктов дегидрогеназной реакции – восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотид или его фосфат (НАДН или НАДФН) – имеет максимум поглощения при длине волны 340 нм, а их окисленные формы при этой длине волны практически не поглощают (рис. 2.5). УФ-тест Абсо рбц ия в р е м я буфер реактив проба Конечная точка Бланк по рабочему раствору А = А общ – А бланка Бланк по кювете 113 может быть использован для определения скоростей тех реакций, в которых не участвуют НАД или НАДФ, но образующиеся продукты в сопряженных ферментативных реакциях приводят к окислению НАДН или восстановлению НАД (непрямой оптический тест Варбурга). Таблица 2.1 Рабочая таблица для определения концентрации аналита методом измерения с бланком по рабочему реактиву Бланк Стандарт Проба Рабочий раствор 1 мл 1 мл 1 мл Дистиллированная вода 10 мкл – – Стандарт – 10 мкл – Проба – – 10 мкл Перемешать, измерить оптическую плотность через 5 мин инкубации Содержание аналита в пробе ( пробы С ) рассчитывается по соотношению бланка стандарта бланка пробы пробы А А А А С Рис. 2.5. Спектры поглощения НАД + и НАД Н. Восстановление НАД + до НАД Н прослеживается при 340 нм – при этой длине волны имеется максимум поглощения НАД Н, а НАД + не поглощает свет При кинетическом определении вычисляют изменение экстинкции за 1 мин и рассчитывают активность по формуле: мин E v l V A 1000 , где А – активность фермента, измеряемая в международных единицах (МЕ или Ед или U), определяется как количество фермента, которое катализирует превращение 1 микромоля (мкмоль) субстрата в 1 минуту. Каталитическая 114 активность фермента выражается числом единиц, рассчитанных для 1 литра биологической жидкости (Ед/л). V – объем реакционной смеси, мл; 1000 – коэффициент перерасчета на 1 л сыворотки; – коэффициент миллимолярной экстинкции НАДН в реакции 6,22 л/(ммоль см); l – длина оптического пути (1 см); v – объем пробы (сыворотки крови или другого материала), мл; E – изменение экстинции за 1 мин. Результат арифметических вычислений для первой дроби формулы является фактором (F). Значение фактора вводится в программу фотометра или биохимического анализатора, в результате активность фермента рассчитывают следующим образом: мин E F A / . При определении активности ферментов с использованием диагностических наборов известен используемый хромоген (следовательно, известен его коэффициент молярной экстинкции), установлены объем реакционной среды и объем образца, измерение проводится в кювете с длиной оптического пути 1 см. Поэтому расчет активности фермента проводится по фактору (F), умноженному на E/мин. Фактор приводится в инструкциях для разных температур инкубации. В современных программируемых фотометрах и биохимических анализаторах все расчеты программируются, и результаты получаются в конечном виде. жүктеу/скачать 4,09 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|