С курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров
жүктеу/скачать 2,61 Mb. Pdf көрінісі
|
Глава 20. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ТРОМБОЛИТИКОВ И АНТИКОАГУЛЯНТОВ 247 течение 60 мин. Применение рекомбинантной проурокиназы сопровождается реканализацией сосуда, но вызывает геморрагические осложнения. Рекомбинантную проурокиназу применяют интраартериально, в сопровождении низких доз внутривенно вводимого гепарина. Тромболитики III–V поколений пока проходят доклинические и клинические испытания. 20.2 Получение и стандартизация тромболитиков Получение t-PA (тканевого активатора плазминогена). Содержание данного вещества варьирует в широких диапазонах в различных тканях. Вещество, полученное из матки человека, имеет молекулярную массу (ММ) 69000 и состоит из двух разных по размеру полипептидных цепей, а полученное из сосудов человека – ММ 60000 и состоит из двух одинаковых по размеру цепей. Могут существовать и одноцепочечные формы. Активирует превращение плазминогена в плазмин (протеолитический фермент), который вызывает лизис тромба. Источник получения mt-PA (меланомный активатор) – клетки меланомы человека. ММ такого полипептида составляет 72000. Могут быть получены одно- и двуцепочечные формы. Клетки меланомы культивируют на среде Игла с добавками натрия гидрокарбоната, L-глютамина и инактивированной нагреванием телячьей сыворотки. Культивируют в монослое. Очистку проводят аффинной хроматографией. Сорбенты: конканавалин А, п-аминобензамидин, имидинодиуксусная кислота, борная кислота, лизин (5 сорбентов). Имеется рекомбинантная технология получения (rt-PA – рекомбинантный активатор). Используют рекомбинантные штаммы E. coli, Saccharomyces cerevisiae. Ген t-PA локализован в 8-й хромосоме человека. Индуцируют синтез t-PA культурой меланомы, выделяют мРНК, на основе которой получают кДНК. кДНК лигируют с плазмидой рBR322. Полученную рекомбинантную ДНК трансформируют в E. coli и определяют полученные трансформанты. Культивирование рекомбинантного штамма E. coli осуществляют в стандартных условиях (L-бульон, 30ºС, рН=7,0–7,2, перемешивание, аэрация). Биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием, затем ресуспензируют в буферном растворе и |