Фармацевтическая

308
Рис. 283.
Денситограмма восьми фосфолипидов 
Y
= 43,5 + 0,06099
x
; 
r
= 0,99694; 
sdv
= 1,81% 
Проба — экстракт липидов. 
Стандарты: растворы стандартов фосфолипидов с концентрацией 
0,1 мг/мл в смеси хлороформ : метанол (2:1). 
Условия хроматографирования: ВЭТСХ пластины: HPTLC Si 60 F254, 
размер 20
×
10 см (Merck). Нанесение: 2–10 мкл распылением с шириной трека 
8 мм, с отступом слева 20 мм и отступом от нижнего края пластины 8 мм. Элю-
ент (система): хлороформ : метанол : вода очищенная : водный аммиак 25% 
(60:34:4:2). Элюирование: ADC 2 с блоком контроля влажности при 47% (на-
сыщенный раствор калия роданида), насыщение камеры 20 мин (с фильтро-
вальной бумагой), 10 мл элюента в каждую воронку камеры. Дистанция: 60 мм 
от нижнего края пластины. Сушка: 5 мин холодным воздухом (автоматически). 
Окрашивание: сульфат меди (II): погружение в раствор на 6 с. Сушка 30 с хо-
лодным воздухом и нагрев при 140°C в течение 30 мин на ТСХ Plate Heater III. 
Оценка: с помощью Visualizer в режиме отражения на «белом свете». 
Денситометрия: на CAMAG TLC Scanner 4 с программным обеспечением 
winCATS в режиме поглощения на 360 нм с дейтериевой лампой, 420 или 
720 нм с галогеновой лампой. Возможна видеоденситометрия с системой 
Visualizer (с дополнительной программой VideoScan) в режим отражения с ос-
вещением белой лампой. Расчет через высоту или площадь пика с полиноми-
нальной регрессией (рис. 284). 
308

309
Рис. 284.
Градуировочная кривая для фосфатидилхолина 
Пример детекции и количественного определения алкалоидов на примере 
алициклического алкалоида капсаицина в плодах Capsicum annuum, Capsicum 
frutestens методом ВЭТСХ (application notes A-85.1 Camag, Швейцария). 
Пример 120.
Этот метод используется для детекции и количественного 
определения капсаицина и дегидрокапсаицина методом ВЭТСХ и с последую-
щим денситометрическим количественным определением. Образцы экстрактов 
из растений Capsicum annuum, Capsicum frutestens хроматографированы на пла-
стине RP-18 и количественно оценены в УФ области при длине волны 200 нм. 
Использованное оборудование компании Camag (Швейцария): Automatic 
TLC Sampler 4 or Linomat 5, Automatic Developing Chamber ADC 2 or Twin 
Trough Chamber 20
×
10 cm, TLC Scanner 3 and winCATS software. 
Пробоподготовка: 10 мл стандартизированного экстракта плодов перцев 
Capsicum annuum, Capsicum frutestens в соответствии с Европейской фармако-
пеей Vol. 7 (с содержанием от 0,020 до 0,060%) или соответствующая сумма 
образцов смешаны с 10 мл н-гексана и в последующем разделены методом 
ВЭТСХ. 
Стандартный раствор: приготовление раствора стандартного образца I: 
2 мг капсаицина растворили в 100 мл трет-бутилметилового эфира, и объём 
раствора доведён до метки в 100 мл (концентрация 20 нг/мкл). Приготовление 
раствора стандартного образца II: 5 мл раствора I растворяют в 20 мл трет-
бутилметилового эфира, и объём раствора доведён до метки в 20 мл (5 нг/мкл) 
(табл. 48). 
Условия хроматографирования: неподвижная фаза — хроматографиче-
ские пластины RP-18 размером 20
×
10 см (Merck). Ход выполнения: 2 мкл рас-
твора образца I, а также 2, 4, 8 раствора стандартного образца II; 3, 4, 5 мкл рас-
309

310
твора стандартного образца I нанесены на хроматографическую пластину при 
помощи автосемплера диаметром по 8 мм на расстоянии в 2 мм между пятнами 
и 8 мм от края пластины. 
Таблица
 48 
Параметры растворов стандартных веществ 
Раствор стандартного образца II 
(5 нг/мкл) 
Раствор стандартного образца I 
(20 нг/мкл) 
2 мкл 
4 мкл 
8 мкл 
3 мкл 
4 мкл 
5 мкл 
10 нг 
20 нг 
40 нг 
60 нг 
80 нг 
100 нг 
Элюент: смесь метанол : вода очищенная (8:2). Пластина 20×10 см. На-
сыщение парами раствором для элюирования в автоматической камере с кон-
тролем влажности ADS 2 в течение 20 мин через бумажный фильтр. Объём рас-
твора для элюирования — 10 мл. Фронт растворителя — 70 мм. Сушка пласти-
ны в течение 5 мин холодным воздухом. 
Условия денситометрии: сканер TLC Scanner 3 с программой winCATS 
software. Спектр снимают при длине волны 200 нм, дейтериевая лампа. Оценка 
производится по высоте пика методом полиноминального регресса (рис. 285, 
286). 
Количественное определение агликонов на примере денситометрии экс-
трактов гинкго двулопастного на предмет детекции и количественного денси-
тометрического определения гинкголидов А, В, С (application notes A-92.1 Ca-
mag, Швейцария). 
Рис. 285.
Денситограмма раствора стандартного образца капсаицина в образце. 
Дегидрокапсаицин обозначен стрелкой. Пик его ниже пика капсаицина 
310

311
Рис. 286.
Калибровочная кривая количественного определения капсаицина 
в экстрактах Capsicum annuum, Capsicum frutestens 
Пример 121.
Этот метод используется для детекции и количественного 
определения гинкголидов А, В, С методом ВЭТСХ и с последующим денсито-
метрическим количественным определением. Этот метод подходит для определе-
ния количества агликонов гликозидов в сухом экстракте гинкго двулопастного. 
Использованное оборудование компании Camag (Швейцария): Automatic 
TLC Sampler 4 or Linomat 5, Automatic Developing Chamber ADC 2 or Twin 
Trough Chamber 20
×
10 cm, TLC Scanner 3 and winCATS software. 
Пробоподготовка: 0,1 г сухого экстракта подвергают ультразвуковой об-
работке в течение 10 мин в 10 мл метанола. Подвергают центрифугированию. 
Супернатант (надосадочная жидкость) используется для идентификации и ден-
ситометрического количественного определения. 
Стандартный раствор: для приготовления раствора стандартного и образ-
ца взято 5 мг стандартного образца билобилида, по 1 мг гинкголида А, В и С в 
20 мкл метанола. 
Условия хроматографирования: приготовление растворов стандартных 
веществ — 8 г натрия уксуснокислого растворяют в 200 мл смеси этанол : вода 
очищенная (3:2). Хроматографические пластины погружают на 2 с в раствор 
элюента и подвергают последующему высушиванию при комнатной темпера-
туре в течение 5 мин. Затем пластины нагревают при температуре 90
°
С в тече-
ние 30 мин в сухо-жаровом шкафу. Неподвижная фаза — пластина с силикаге-
лем 60 F
254
, пластины размером 20×10 см (Merck), импрегнированные натрия 
ацетатом. Внесение образцов: от 5 до 15 мкл испытуемого раствора и 2, 5, 7, 10 
и 25 мкл раствора стандартного вещества наносятся на пластину. Размер пя-
тен — по 8 мм. Расстояние между пятнами — 2 мм. Расстояние от нижнего края 
пластины — 8 мм. Раствор элюента — толуол : этилацетат : ацетон : метанол 
311

312
(20:10:10:1,2). Пластина хроматографируется в камере ADC 2, насыщается в те-
чение 20 мин. Высота фронта растворителя — 70 мм. Пластина высушивается 
струёй холодного воздуха в течение 5 мин. Детекция проводится при длине 
волны 366 нм (табл. 49). 
Таблица
 49 
Параметры треков при идентификации гинкголидов А, В, С 
Трек 
Объём исследуемого 
раствора, мкл 
Введённые образцы 
1 
2 
Смешанный раствор стандартных веществ (билобалид, 
гинкголиды А, В, С) с пониженным значением индекса Rf 
2 
5 
Сухой экстракт Гинкго 1 
3 
5 
Сухой экстракт Гинкго 2 
4 
5 
Раствор смеси стандартных образцов веществ 
5 
15 
Сухой экстракт Гинкго 3 
6 
5 
Сухой экстракт Гинкго 4 
7 
7 
Раствор смеси стандартных образцов веществ 
8 
5 
Сухой экстракт Гинкго 5 
9 
15 
Сухой экстракт Гинкго 6 
10 
10 
Раствор смеси стандартных образцов веществ 
11 
10 
Сухой экстракт Гинкго 7 
12 
15 
Сухой экстракт Гинкго 3 
13 
10 
Сухой экстракт Гинкго 7 
14 
25 
Раствор смеси стандартных образцов веществ 
15 
10 
Сухой экстракт Гинкго 7 
Дериватизация: для дериватизации используют уксуснокислый ангид-
рид, который автоматически распыляется на пластину. На пластину распыля-
ют уксуснокислый ангидрид и нагревают пластину при температуре 180
°
С 
(рис. 287). 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
11 
12 
13 
14 
15 
Рис. 287.
Вид хроматограммы в УФ-спектре после дериватизации 
Оценка результатов: по высоте хроматографического пика с использова-
нием статистического критерия полимодальной (линейной) регрессии. 
Денситометрия: проводится при помощи сканера Camag TLC Scanner с 
программным обеспечением winCATS при длине волны 300 нм (после дерива-
тизации) с использованием дейтериевой лампы (рис. 288–292). 
312

313
Рис. 288.
Калибровочная кривая при длине волны 300 нм после дериватизации 
для гинкголида А 
Рис. 289.
Калибровочная кривая при длине волны 300 нм после дериватизации 
для билобалида 
Рис. 290.
Калибровочная кривая при длине волны 300 нм после дериватизации 
для гинкголида В 
313

314
Рис. 291.
Калибровочная кривая 
при длине волны 300 нм после дериватизации 
для гинкголида С 
Рис. 292. 
Денситограмма раствора стандартного образца (слева) 
и сухого экстракта Гинкго (справа) 
314

315
3.2. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 
В ТОНКОМ СЛОЕ СОРБЕНТА 
Тонкослойная хроматография (ТСХ) является разновидностью планарной 
жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза движется в пористой 
среде плоского слоя сорбента под действием капиллярных сил. Скорость дви-
жения вещества определяется соотношением времени его удерживания в по-
токе элюента и удерживания за счет сорбции на неподвижной фазе. При 
движении элюента вдоль плоскости каждая молекула или ион растворенного 
вещества участвует в многочисленных актах сорбции и десорбции. В про-
цессе хроматографирования зона каждого вещества проходит характерное 
расстояние, определяемое его природой. Обычно эти зоны размыты за счет 
флуктуации средней скорости движения индивидуальных молекул вдоль пла-
стины. 
Величина R
f
в ТСХ. 
В соответствии с коэффициентами распределения разделяемые компо-
ненты переносятся подвижной фазой вдоль слоя сорбента, образуя отдельные 
зоны. Положение каждой зоны характеризуется величиной R
f
(rate fraction) — 
физический смысл которой определяется отношением скоростей движения 
зоны определяемого вещества и элюента. Поскольку на практике измерить эти 
величины трудно, величину R
f
, называемую подвижностью, экспериментально 
определяют как отношение расстояния, пройденного веществом от точки 
нанесения пробы до центра зоны, к расстоянию, пройденному элюентом от 
линии старта до линии фронта элюента за то же время. 
Величина R
f
является индивидуальной характеристикой соединения, хро-
матографируемого в данном растворителе, в условиях опыта и изменяется от 0 
до 1. Оптимальным для практической ТСХ является интервал изменения R
f
от 
0,2 до 0,8. При R
f
= 0 вещество не движется, при R
f
= 1 вещество не задержива-
ется неподвижной фазой и движется с фронтом растворителя. Иногда для полу-
чения более надежных результатов подвижность соединений оценивают по от-
ношению к подвижности вещества, выбранного в качестве стандарта, свидетеля 
или эталона. 
Идентификация по регистрации поглощения веществ в УФ-области или 
их собственной флуоресценции основана на введении в слой адсорбента флу-
оресцентных индикаторов (люминофоров), которые при облучении УФ-светом 
возбуждаются при такой длине волны, при которой детектируемые вещества 
поглощают. При этом они становятся хорошо видны в виде темных зон на зе-
леноватом светящемся фоне сорбента. Выпускаются пластины с флуоресцент-
ными индикаторами: 254 и 365 нм. Одним из наиболее чувствительных явля-
ется способ детектирования, в котором наблюдают собственную флуоресцен-
цию вещества при облучении пластин УФ-светом соответствующей длины 
волны. Имеются специальные средства, усиливающие флуоресценцию неко-
торых веществ. Многие вещества, не флуоресцирующие и не фосфоресциру-
315

316
ющие в УФ-свете при комнатной температуре, становятся видимыми при тем-
пературе жидкого азота. 
При детектировании с помощью химических реагентов в качестве уни-
версальных проявляющих реагентов используют концентрированные кислоты, 
в первую очередь — серную кислоту. После опрыскивания пластин некоторые 
соединения видны на холоде, многие проявляются после нагревания при раз-
ных температурах. Для обнаружения химически инертных соединений к серной 
кислоте добавляют 5%-ную азотную кислоту или окислители (KmnO
4
, 
K
2
Cr
2
O
7
). Широко применяют в ТСХ пары йода, особенно для обнаружения не-
предельных органических веществ. Опрыскивание пластин обычно проводят 
метанольным раствором йода. Многочисленную группу составляют специфи-
ческие реагенты на индивидуальные соединения и отдельные классы соедине-
ний, растворами которых также опрыскивают пластину. Особенностью ТСХ 
является возможность последовательного использования нескольких реагентов 
для детектирования разных классов соединений или соединений с разными 
функциональными группами. 
Для опрыскивания пластин применяют пульверизаторы разной конструк-
ции или коммерческие препараты реагентов в аэрозольной упаковке. Точность 
количественных определений сильно зависит от качества и воспроизводимости 
детектирования, в особенности при опрыскивании хроматограмм. Широко 
используют в ТСХ предварительную или постдериватизацию исследуемых 
соединений, основанную на получении производных определяемых веществ. 
Целью дериватизации является повышение чувствительности анализа за счет 
введения хромофоров или флуорофоров в молекулы исследуемых соедине-
ний. Предварительная хроматографическая дериватизация может повысить 
специфичность разделения компонентов смеси, увеличить их стабильность, из-
менить адсорбционную активность, улучшить растворимость или другие свой-
ства анализируемых веществ. Однако эта стадия является дополнительной в 
хроматографическом процессе; она может быть достаточно трудоемкой и дли-
тельной. 
Постхроматографическая дериватизация — это практически также метод 
детектирования уже разделенных компонентов. Преимущество этого метода в 
том, что дериватизация всех компонентов пробы происходит одновременно и 
не влияет на хроматографическое разделение химически близких веществ. До-
полнительным способом идентификации веществ является определение R
f
раз-
деленных соединений и сравнение их с R
f
стандартных образцов, хроматогра-
фируемых в тех же условиях. Его можно использовать вместе со специфиче-
скими реагентами и определением структуры веществ независимым методом, 
например ИК-спектроскопией. Новые возможности для идентификации много-
компонентных смесей дает спектроденситометрический метод, который позво-
ляет получить информацию как о качественном, так и количественном составе 
пробы на основании электронных спектров диффузионного отражения. По по-
лученным спектрам выбирают оптимальную длину волны для количественного 
определения исследуемых соединений. 
316

317
Идентификация соединений. 
Определение площади пятна. Простейшим 
способом площадь пятна измеряют при помощи планиметра или миллиметро-
вой бумаги. Предварительно для ее оценки строят градуировочный график. 
Другим вариантом является метод внутреннего стандарта. 
При этом готовят три раствора: 
1) с известной концентрацией определяемого вещества; 
2) разбавленный в 10 раз первый раствор; 
3) второй раствор с добавлением определенного количества стандарта. 
Количественное определение. 
Метод количественного переноса пятна 
сорбента, содержащего

жүктеу/скачать 66,35 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: