Жумина Асем Галымовна Тулегенова Сымбат Ержанқызы «Жасушалық биотехнология» пәні бойынша
жүктеу/скачать 4,2 Mb.
|
multi-213 x606468403
| 2. Протопласттарды бөлу кезеңдері
Протопластты бөлудің үш сатысы: Ферменттермен өңдеу. Жасуша қабықшасынан протопласттарды бөлу. Жасуша жарықшақтарынан интакті протопласттарды бөлу. Протопласттарды (Такебе бойынша) Nicotiana tabacum жапырақ ұлпаларынан бөліп алудің стандартты әдістемесі (сур.42). Жетілген, қалыптасқан жапырақты 60-80 күндік өсімдіктен ажыратып, 70% этанолға батырып, кейін 15 – 20 минутқа 10% кальций кипохлорит ерітіндісіне салады да, дистелденген сумен бірнеше рет шаяды. Пинцеттің көмегімен астыңғы эпидермисті шешіп, эпидермистен тазаланған жапырақтарды скальпельмен көлемі 4 км.см болатын бірнеше бөліктерге кеседі. Жапырақтардан эпидермис жақсы шешілуі үшін жапырақтар кішкене солуы керек немесе жапырақтарды кесінділеу алдында сумен қамтамасыз етуді уақытша тоқтата тұру қажет. Ары қарай ұлпаны бір мезетте немесе реттілікпен мацерация тудыратын пектиназа және жасуша қабықшасын бұзатын целлюлозамен өңдейді. Өңдеу уақыты секілді ферменттер концентрациясының оптималдылығы әр ұлпа үшін әр түрлі болады. Протопласттар ферментті ерітіндіде аз уақыттай болып, кейін міндетті түрде мұқият шайылуы қажет. Ферменттер бактериялық сүзгілер арқылы стерильдейді. Сурет 2. Такебе бойынша протопласттарды алу сызбасы Жасушаның су алмасу реттілігі жасуша қабықшасының болуына байланысты. Протопласт «жалаңаш» болған кезде су алмасу реттілігінің компоненттерінің бірі жоғалады, сол себепті дақылдау және бөлу орталарының осмостық құрамы маңызды роль атқарады. Протопласттар кішкене плазмолизденген жағдайда болуы үшін орта гипертоникалық болуы қажет. Бұл жағдайлар жасуша қабықшасының қайта қалпына келу және метаболизм процестерін тежейді. Осмостық реттеушілер ретінде концентрациясы 0,3 - 0,8 моль/литр болатын қант (глюкоза, маннит, сорбит, ксилоза), ионды осмотиктер (CaCl 2 , KCl) қолданылады. Әрбір өсімдік объектілері үшін концентрация жеке таңдалады. Ұлпаларды Петри табақшасында ферменттермен өңдеу ыңғайлы. Протопласттармен ферменттердің қоспасын центрифугалы пробиркаларға ауыстырады. Протопласттарды ферментті қоспадан екі жолмен ажыратып алуға болады: флотация немесе центрифугалау арқылы фильтариялау. Фильтрация кезінде қоспаны өлшемі 40 мкм болатын сүзгілерден өткізеді. Сүзгіде жасушалардың түйіршіктері және үлкен сынықтар қалады. Ары қарай центрифугалау кезінде протопласттар тұнып, сынықтар супернатантта қалады. Қайта центрифугалау кезінде ферменттердің шайылуы жүреді, кейін протопласттар дақылдау ортасына көшіріледі. Флотация әдісін 1981 жылы О. Гамборг қызметкерлерімен ұсынылған болатын, және ол әлсізденген протопласттарға арналған болды. Ол протопласттардың органеллалар немесе жасуша қабықшасының қалдықтарына қарағанда төмен тығыздығымен негізделген. Қорытынды қоспаға сахароза ерітіндісін қосып, 40 – 80 –нен 350g. Жылдамдықпен центрифугалайды. Таза протопласттар қалқып, сынықтар түбіне тұнады. Протопласттарды суспензиялы және жасушалық өсіріндіден бөліп алуға болады. Логарифмдік өсудің соңғы стадиясында жасушалық қабықшалар бұзылуға икемді кезінде протопласттар тіршілікке қабілетті болады. Әрі қарай жасушалар дақылданатын жағдайдағыдайпротопласттар да дақылданады. Тұздардың құрамы кішкене өзгеруі мүмкін. Орта осмостық реттегіштен, бейорганикалық қосылыстардан, көміртек көзінен, азот, дәрумендер, фитогормондардан тұрады. Дақылдау талаптары: рН ортасы 5,4 – 5,8, температурасы 22 – 280С, жарықтылық (2000лк-нан көп емес). 70 % этанол+10% гипохлорит кальция Пектиназа+Целлюлаза жүктеу/скачать 4,2 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|