119
бөліп алу үшін гомогенизаторда гомогенизациялайды (2-3 сатыда 30
с сайын 1 мин бойы). Гомогенизациядан кейін материалды тығыз ней-
лон арқылы фильтрлейді. Фильтрлеу үшін су ағызатын сорғы мен кең
Бюхнер шұңғымасын пайдаланған ыңғайлы. Алынған фильтратты 300
айналымда (g) 20 мин бойы центрифугалайды. Нəтижесінде ядро мен
клеткалық дебрис тұнба түзеді. Тұнбаүстілік фракцияны жаңа түтiкке
ауыстырып, 4000 айналымда 20 мин бойы хлоропластар тұнбаға түсу
үшін центрифугалайды. Құрамында митохондриясы бар тұнбаүстілік
фракцияны таза түтiкке құйып алады. Хлоропластар тұнбасына 10 мл
буфер І қосады, ақырын ресуспендирлейді де, қайтадан центрифуга-
лайды. Алынған тұнбада интакты хлоропластар болады.
Митохондриясы бар тұнбаүстілік фракцияны 10000 айналымда (g)
30 мин бойы митохондрияны тұнбаға түсіру үшін центрифугалайды.
Органеллалардың лизисі мен хлоропласты жəне митохондриялық
ДНҚ-ны бөліп алу. Интакты хлоропласт пен митохондриясы бар
тұнбаны 500 мкл буфер II ресуспендирлейді, буфер ІІ келесі зат-
тардан тұрады: 100 мМ Трис (рН 7,5); 25 мМ ЭДТА; 200 мМ NaCl;
0,1%-ті 2-меркаптонол, 1%-ті SDS. Ядролардың толық лизисі үшін
ерітіндіні 65°С 15-20 мин бойы инкубациялайды. Фенол мен хлоро-
форм қоспасының тең көлемін қосады, гомогенді эмульсия түзілгенше
араластырады. 12000 айналымда (g) 5 мин бойы центрифугалайды. Су
фазасын жаңа түтiкке жинап алып, фенол мен хлороформ қоспасымен
депротеинизацияны қайталайды. Су фазасын іріктеп, оған 5 М натрий
ацетатының 1/10 бөлігін қосады да, араластырады. Салқын изопро-
пил спиртін қосып ДНҚ тұнбаландырады. 1 сағатқа -20°С қалдырады.
12000 айналымда (g) 30 бойы центрифугалайды. Тұнбаүстілік сұйықты
төгіп тастайды да, тұнбаны бірнеше рет 300 мкл 70%-тік этанолда ша-
яды. Тұнбаны кептіріп, дистильденген суда немесе ТЕ-буферде ерітеді.
Бұл буфер 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА құрайды. Хлоропласты жəне
митохондриялық ДНҚ ерітінділерін -20°C-та сақтайды.
Алынған ДНҚ 5 рестрикциялық талдауы жəне 50 ПТР (ПЦР) өткізу
үшін жеткілікті болады.
Достарыңызбен бөлісу: