Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
| 3.14. ДНҚ-ны талдау əдістері
Электрофорез арқылы ДНҚ-ны бөлу принциптері. Электрофорез əдісі электр өрісінде молекулаларды бөлуге негізделген. Электрофорез əдісі көмегімен əртүрлі нуклеотид ұзындықтағы бар ДНҚ-ның немесе РНҚ-ның фрагменттерін бөлу мүмкіншілігі бар. Сондықтан осы əдіс биотехнологияда, əсіресе молекулалық генетикада кең пайдаланыла- ды. 30 жыл бойы нуклеин қышқылдарының құрылымын зерттеу үшін электрофорез негізгі əдіс болып табылады. Нуклеин қышқылдарының (НҚ) электрофорезі белоктарды бөлу үшін 50 жылдарда дамыған əдістің арқасында өңделген болатын. Электрофорез көмегімен макромолекуларды (белоктар, НҚ) бөлуге қарапайым электрохимиялық принциптері жатады: 1. Ортақ электрофоретикалы кондуктивті ортаны қолдану. Осы ор- тада тікелей катион ретінде трис ерітіндіні пайдаланады. 2. ДНҚ-ның фосфаттық қаңқасында теріс зарядының болуы. Бөлінетін матриксте (гельде) ДНҚ-ның фосфаттық қаңқада бөлуші кернеу градиенті қасиеті болады. Электрофорез арқылы ДНҚ-ны бөлу үшін агароза жəне полакрила- мидті гельді (ПААГ) пайдаланады. Агарозды гельдегі электрофорез ДНҚ бөлiктерін бөлу үшін, сəйкестендіру жəне тазалау үшін қолданылатын стандартты əдіс бо- лып табылады. Осы қарапайым техника көмегімен басқа əдістермен бөлінбейтін, (мысалы, центрифугалаумен) ДНҚ фрагменттерінің қоспаларын тез бөлуге болады. Сонымен қатар ДНҚ бөлiктерінің та- ралуын байқалау ыңғайлы, себебі гельде оның сызықтары флуоресцен- циялайтын жəне интеркаляциялайтын (ДНҚ-ға ендіруші) бояғыштар- мен – этидий броммен жақсы боялады. Гельді ультракүлгінде қарай отырып, тіпті бірнеше нг ДНҚ-сын табуға болады. Ерітіндіде ДНҚ анион түрінде болады жəне ерітіндіні конден- сатордың арасына ауыстыру кезінде молекулалар оң зарядталған өріске қарай жылжиды. Неғұрлым молекула ұзын болса, соғұрлым оның заряды мен электр өрісінің əсер етуші күші үлкен болады, бірақ бұл кезде ортаның қарама-қайшылығы да жоғарылайды. Дегенмен ол өте жылдам өседі, сондықтан молекулалардың қозғалу жылдамдығы 130 молекуланың мөлшеріне байланысты. Егер осы аталған іс-шараны ерітіндіде жүргізсек, онда ДНҚ бөлiктерін бөлуге мүмкіндік болмай- ды. Сондықтан нуклеин қышқылдарының электрофорезін тасушыда жүргізеді. Бұнда тасушы ретінде гель, яғни полимердің концентрлен- ген ерітіндісі (агарозды немесе акриламидті) атқарады. Əдістің атауы да осыдан шықты. Гель үш өлшемді полимерлі тор түзеді жəне олардың ұяшықтары еріткішке толы болады. Бұл тор қаттылық құрылымды береді жəне салмақ бойынша гельдің тек бірнеше процентін құрайды. Сонымен қатар бұнда гельдің өзі электробейтарапты. Сонымен, электрофорез жүргізілетін гельді орта ретінде қолдану кезінде ДНҚ бөлiктерін бөлу мəселесін шешуге болады. 3.6-сурет. Əртүрлі нуклеотид ұзындықтағы бар ДНҚ фрагменттерінің қоспасын электрофорез арқылы электрофорездеп бөлу. Төменгі оң жақта ДНҚ-ның қараңғы жолақпен агарозды гель көрсетілген (У. Клаг, М. Каммингс, 2007) 131 Гельде электр өрісінің əсерімен ДНҚ-ның молекулалары əртүрлі жылдамдықпен қозғалады. Егер ДНҚ-ның молекулаларында молекула- лық салмағы жəне нұсқасы бірдей болса, сонда төмендеу заряды бар молекулалар қос заряд болатын полюске баяулау қозғалады, ал ұлғаю заряды бар молекулалар жылдамырақ көшеді. 3.6-суретте көрсетілгендей, неғұрлым молекула кіші болса, соғұрлым гельде оның миграциялану жылдамдығы артады. Гельдің құрылымына байланысты ондағы үлкен молекулалар кіші молекула- лармен салыстырғанда еркін қозғалмайды. Электрофорез тоқтағанда бөлінген ДНҚ бөлiктерін авторадиография көмегімен (егер ДНҚ изотоптармен белгіленсе) немесе гельде ДНҚ-мен байланысатын флуоресцентті бояғыштармен сəйкестендіреді. Сонымен, электрофорез əдісімен əртүрлі мүшелерінің алынған тұтас клеткаларан мен ядролардан бөлінген ДНҚ бөлiктерінің мөл- шерін анықтауға болады. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|