Л. Х. Гордон доктор биологических наук, профессор

ление цГМФ имеет преходящий характер (рис. 32). Участие 
цГМФ в сигнальной сети клеток определяется его способ-
ностью активировать некоторые протеинкиназы, откры-
вать катионные каналы и регулировать активность фосфо-
диэстераз.
В отличие от животных, в NO-синтазной системе расте-
ний принимает участие салициловая кислота в качестве по-
средника между N0 и геномом [Durner et al., 1998; Hausladen, 
Stamler, 1998; McDowell, Dangl, 2000; Kumar, Klessig, 2000]. 
Изучение с помощью иммуноблотинга синтеза некоторых 
белков, индуцируемых различными интермедиатами NO-
синтазной системы, в сочетании с использованием ингиби-
торов гуанилатциклазы и трансгенных растений с привне-
сенным бактериальным геном салицилат-гидроксилазы по-
зволил прийти к выводу о разветвленной структуре этого 
сигнального пути. О первой точке ветвления можно судить 
по открытию цГМФ-зависимой и независимой NO-индук-
ции фенилаланин-аммиак-лиазы, о второй - по NO-индуци-
рованному салицилатзависимому образованию матричных 
РНК белка PR-1 и NO-индуцированному салицилатнезави-
симому образованию фенилаланин-аммик-лиазы [Durner et 
al., 
1998]. Многократное накопление салицилата под влия-
нием NO было показано во многих работах, и в связи с этим 
были оправданы исследования взаимосвязей NO и салици-
лата при функционировании NO-синтазной сигнальной сис-
темы. Существование NO-индуцированного цАДФрибоза-
зависимого- и цАДФрибозанезависимого синтеза белков 
(PR-1) [Klessig et al., 
2000] предполагает еще одну точку 
ветвления NO-сигнального пути. Обслуживает NO-синтаз-
ную систему, помимо NO-синтазы, еще целый ряд фермен-
тов, активируемых различными интермедиатами этого сиг-
нального пути [Klessig et al., 2000]. Монооксид азота активи-
рует гуанилатциклазу, катализирующую образование 
цГМФ, который, в свою очередь, активирует цГМФ-зависи-
мую протеинкиназу, а последняя - факторы регуляции 
транскрипции (NO -> цГМФ -> ПК -> ФРТ -> геном) и каль-
циевые каналы (NO —> цГМФ —» активация кальциевых ка-
налов —> повышение концентрации ионов кальция в цитозо-
ле —> Са-зависимые ПК —> ФРТ -> геном). Салициловая кис-
лота, накапливающаяся в результате гидролиза глюкозил-
салицилата или активации ФАЛ, способна активировать
специальную изоформу МАР-киназы (СК —> салицилатин-
дуцируемая МАР-киназа -» ФРТ -> геном). Циклический 
гуанозинмонофосфат способен активировать АДФ-рибо-
зил-циклазу, катализирующую образование цАДФрибозы, 
а последняя открывает кальциевые каналы (цГМФ —» 
цАДФрибоза —> повышение содержания Са
2+
в цитозоле -» 
Са-зависимые ПК —> ФРТ —> геном).
NO 
является весьма активным свободным радикалом 
(время его жизни in vivo составляет, по-видимому, немно-
гим более 10 с), он способен взаимодействовать с нуклеи-
новыми кислотами и белками неферментативно (рис. 33). 
Так, было обнаружено, что у животных NO изменяет ак-
тивность железорегуляторного белка цитоплазмы (ЖРБ), 
который связывает специфический элемент матричных 
РНК и поэтому активирует или ингибирует их [Klausner et 
al., 
1997]. Оказалось, что у растений NO оказывал влияние 
на изоформу ЖРБ - аконитазу, вызывая ее ингибирова-
ние, что косвенно свидетельствует (наряду с существова-
нием протяженных консервативных последовательностей 
у этих ферментов) о возможности влияния NO на процес-
сы трансляции непосредственно, неферментативно, минуя 
классические и относительно долгие ферментативные сиг-
нальные пути. По-видимому, NO может влиять и на про-
цессы транскрипции, если учитывать факт ингибирования 
им ДНК-связывающей активности факторов регуляции 
транскрипции при S-нитрозилировании определенного ци-
стеинового остатка. Кроме того, обнаружено, что экзоген-
ный NO активировал ДНК-метилтрансферазу, что приво-
дило к повышению содержания метилированных остатков 
цитозина в ДНК и, вследствие этого, препятствовало свя-
зыванию факторов регуляции транскрипции с промотор-
ными участками генов и переводу их из активных в "мол-
чащие" [Bogdan, 2001].
Еще один возможный неферментативный путь - нитро-
зилирование монооксидом азота S-белков кальциевых ка-
налов, что приводит к их открыванию и повышает концен-
трацию ионов кальция в цитозоле [Klausner et al., 1997]. Так 
же как и в случае белков кальциевых каналов, нитрозили-
рование цитозольных S-белков может привести к измене-
нию их конформации, а это, в свою очередь, - к атакуемо-
сти протеазами и изменению времени жизни S-белков.

Рис. 33. Схема NO-синтазной сигнальной системы, дополнен-
ная неферментативным влиянием NO на метаболические про-
цессы
ЖРБ - железорегуляторный белок; ПК - протеинкиназа; СИПК -
салицилатиндуцируемая протеинкиназа; ФАЛ - фенилаланин-аммиак-
лиаза; ФРТ - факторы регуляции транскрипции
N0 и образующийся из него пероксинитрит могут окис-
лять тиоловые остатки в белках с образованием сульфено-
вых R-SOH-, сульфиновых R-SO
2
H- 
и сульфоновых R-SO
3
H-
остатков [Bogdan, 2001]. В результате окисления тиоловых 
остатков сульфгидрильные группы могут окисляться до ди-
сульфидных. Обнаружено, что под влиянием NO происхо-
дит разрушение кластеров ZnS в "цинковых пальцах" фак-
торов регуляции транскрипции, и это приводит к повыше-
нию концентрации ионов цинка в цитозоле и ядре.
Неферментативными путями вмешательства N0 в бел-
ковый метаболизм тканей растений могут быть объяснены 
данные о влиянии донора NO - нитропруссида, на набор 
белков, полученные в нашей лаборатории В.Г. Яковлевой. 
Введение в проростки гороха нитропруссида привело уже 
через сутки после начала опыта к изменению набора поли-
пептидов в растениях. Исчезли характерные для контроль-
ных растений полипептиды 19 и 30 кДа и появились новые 
с молекулярными массами 32 и 36 кДа.
Проростки гороха уже давно стали для нашей лабора-
тории модельным объектом, с помощью которого мы ис-
следовали влияние на набор и содержание белков салици-
ловой [Тарчевский и др., 1996а, б; 1999; 2001], янтарной 
|Тарчевский и др., 1999], абсцизовой [Тарчевский и др., 
2001], жасмоновой [Тарчевский и др., 1996а, б] кислот, а 
также инфицирования микоплазмами [Тарчевский и др., 
1996а, б]. Во всех случаях наблюдаемое изменение набора 
полипептидов в растениях отмечалось лишь через несколько 
дней после начала воздействия того или иного исследуемого 
соединения. Через сутки после начала воздействия на 
проростки гороха салициловой кислоты не произошло из-
менения набора полипептидов, наблюдалось лишь некото-
рое относительное (по сравнению с контрольными расте-
ниями) повышение содержания полипептида 34 кДа, Бы-
строе салицилатнезависимое появление этого полипепти-
да, вызванное донором NO нитропруссидом, могло объяс-
няться неферментативной активацией матричной РНК с 
помощью монооксида азота.
Ранее [Durner et al., 1998; Klessig et a!., 2000] было уста-
новлено, что NO вызывал достаточно быстрое появление 
двух белков - PR 1 и фенилаланин-аммиак-лиазы - менее 
чем через 24 ч после начала воздействия, но эти результаты

были получены в опытах с использованием более чувстви-
тельного метода иммуноблотинга.
Быстрое NO-индуцированное салицилатнезависимое ис-
чезновение полипептидов 19 и 30 кДа в опытах, проведенных 
в нашей лаборатории, можно было бы объяснить прекраще-
нием их синтеза. Но это происходило бы лишь в том случае, 
если скорость их оборота была бы очень велика. Возможно, 
что непосредственное взаимодействие NO с этими белками 
приводило к изменению их конформации и, вследствие это-
го, к быстрой деградации с помощью протеаз.
Примечателен тот факт, что многократное повышение 
(всплеск) содержания цГМФ, вызванное N0, было преходя-
щим [Dinner et al., 1998], но синтез NO-индуцированных белков 
продолжался, что свидетельствует о гораздо большем време-
ни жизни более поздних звеньев этого сигнального пути.
Остается неясным, что в NO-синтазой системе является 
рецептором элиситоров, расположены они в плазмалемме 
или цитозоле и принимают ли участие G-белки в качестве 
промежуточного звена между рецептором и NO-синтазой? 
Ответа на этот вопрос не содержится ни в статьях журнала 
"Биохимия" [1998. Т. 63, вып. 7], специально посвященного 
N
0, ни в пока еще немногочисленных статьях о сигнальной 
функции NO у растений. Возникает вопрос: не является ли 
рецептором сама молекула фермента NO-синтазы? К этому 
предположению склоняют ее сложность и присутствие в до-
менах регуляторных цистеиновых сайтов, изменение актив-
ности в ответ на различные эффекторы, такие как цитоки-
ны у животных, на фосфорилирование, существование не-
большого эндогенного белкового ингибитора, препятству-
ющего образованию активной димерной формы фермента. 
Интересно, что мутантные мыши, лишенные каждая одной 
из изоформ NO-синтазы, оказались жизнеспособными, но 
обнаруживали ряд особенностей в поведении. Кроме того, 
мыши, дефектные по индуцибельной NO-синтазе, были бо-
лее чувствительны к инфекциям [Snyder, 1995].
Интенсивные исследования функционирования NO-син-
тазной сигнальной системы у растений должны в ближай-
шем будущем привести к новым интересным фактам, каса-
ющимся локализации ферментов этой системы, регуляции 
их активности, взаимоотношений с другими сигнальными 
системами и т.д.
ПРОТОННАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА
При анализе участия различных сигнальных систем в за-
щитных реакциях против патогенов (образование фитоале-
ксинов и т.д.) необходимо учитывать, что одна из наиболее 
ранних и неопровержимо доказанных реакций клеток на 
действие элиситоров, учитываемых с помощью селектив-
ных электродов или флуоресцирующих рН-индикаторных 
красок, - быстрое преходящее изменение в цитозоле кон-
центрации протонов за счет входа Н
+
из вакуоли и внекле-
точной среды [Conrath et al., 1991; Mathieu et al., 1991; 1994; 
1996; Horn et al., 1992; Nurnberger et al., 1994; Hahlbrock et al., 
1995; Amano et al., 1997; Jabs et al., 1997; Roos et al., 1998]. 
Трансмембранное передвижение протонов происходит по 
градиенту концентрации за счет того, что с внешней сторо-
ны плазмалеммы среда более кислая, чем с внутренней, и 
разница может достигать двух единиц рН.
Так, в культуре клеток табака происходили подкисление 
цитозоля и подщелачивание инкубационной среды, вызван-
ное олигогалактуронидами [Mathieu et al., 1991]. Подкисле-
ние цитозоля и подщелачивание среды наблюдались в сус-
пензионных клетках табака не только при действии олиго-
галактуронидов, но и криптогеина и других элиситоров 
[Mathieu et al., 
1996], причем интенсивность и кинетика сдви-
га рН зависела от вида элиситоров, связывающихся с рецеп-
торами плазмалеммы. Механизм преобразования элиситор-
ных сигналов, приводящий к открыванию протонных кана-
лов, продолжает оставаться невыясненным. Совершенно 
очевидно, что необходимым звеном этого механизма явля-
ется фосфорилирование белков Н
+
-
каналов [Mathieu et al., 
1996]. Показано, что ингибиторы протеинкиназ, например 
стауроспорин, подавляли элиситориндуцируемое подкисле-
ние цитозоля, а ингибитор протеинфосфатаз каликулин А

вызывал снижение рН в цитозоле и повышение рН в сус-
пензионной среде даже в отсутствие элиситора. Это свиде-
тельствует об участии процессов фосфорилирования-де-
фосфорилирования в элиситации изменений рН и заставляет 
с большим вниманием отнестись к представлениям о сиг-
нальной роли трансмембранного изменения концентрации 
протонов [Скулачев, 1989; Polevoi et al., 1996], тем более что 
оно приводило к синтезу классических патогениндуцируе-
мых белков. Примером может служить искусственное под-
кисление цитозоля, которое вызывало образование фенил-
ал анин-аммиак-лиазы [Mathieu et al., 1994]. Продолжают 
оставаться невыясненными интермедиаты протонной сиг-
нальной системы. Обнаружение протонозависимой актива-
ции некоторых изоформ МАР-киназ [Тепа, Renaudin, 1998] 
позволяет выстроить ранее скрытую последовательность 
звеньев протонной сигнальной системы: сигнал —> рецептор —> 
—> 
активация протонных каналов —> подкисление цитозоля —> 
—
> активация МАР-киназ —> активация факторов регуляции 
транскрипции —> изменение программы экспрессии генов.
Обнаружены также активные при пониженных значени-
ях рН изоформы фосфолипазы Д [Munnik et al., 1995] и аде-
нилатциклазы [Carricarte et al., 1988], что может рассматри-
ваться в качестве аргумента в пользу существования протон-
ной системы. С другой стороны, эти эффекты можно расце-
нивать лишь как рычаг дополнительной активации подкис-
лением цитозоля элиситориндуцируемых фосфатидатной, 
МАР-киназной и аденилатциклазной сигнальных систем. 
Имеются также данные о том, что ингибиторы МАР-киназ 
приводят к подавлению подщелачивания внеклеточной сре-
ды, вызванного действием элиситоров [Zhang et al., 1998]. В 
этом случае не протонный импульс находится "выше по те-
чению" сигнальной системы, а МАР-киназное звено.
Важным представляется решение вопроса о том, из ка-
кого источника протоны поступают в цитозоль. С одной 
стороны, имеются данные, что взаимодействие элиситоров 
с липидной фазой плазмалеммы может приводить к неспе-
цифическому входу протонов снаружи внутрь клетки и к 
подкислению цитозоля [Klusener, Weiler, 1999]. С другой 
стороны, показано, что после контакта клеток с элисито-
ром подкисление цитозоля и ядерной области происходит в 
первую очередь за счет подщелачивания вакуоли [Roos et
al., 
1998]. "Протонная вспышка" начиналась практически 
без лаг-фазы и продолжалась в течение десятков минут. Ис-
тощение вакуолярного протонного пула предотвращало 
как элиситорное подкисление цитозоля, так и синтез фито-
алексинов. Подщелачивание внеклеточной среды обнару-
живалось только при более высоких концентрациях элиси-
тора. По мнению авторов, подкисление цитозоля за счет 
выхода протонов из вакуоли - необходимый и достаточный 
шаг в сигнальной системе синтеза фитоалексинов. Насыща-
ло образование фитоалексинов в суспензионных клетках 
мака изменение концентрации протонов, соответствующее 
0,6 единицы рН.
Протонные каналы и Н
+
-
АТФазы не были обнаружены в 
мембранах ядерной оболочки [Matzke et al., 2001], в отличие 
от кальциевых каналов и помп, что свидетельствует о прин-
ципиальных различиях в механизмах регуляции концентра-
ции этих ионов в ядрах клеток, по сравнению с вакуолями.
Преходящий характер протонной вспышки объясняется 
усиливающимся при подкислении цитозоля (рис. 34) функ-
ционированием протонных помп (Н
+
-
АТФаз) плазмалеммы 
|Palmgren, 
1991] и тонопласта. Можно отметить, что АТФа-
за была первым клонированным мембранным белком рас-
тений. В настоящее время уже многие растительные АТФа-
зы клонированы (например, у арабидопсиса - более 40) и 
подразделяются на пять типов [Palmgren, Harper; 1999; 
Palmgren, 
2001]. Структура Н
+
-
АТФаз проще, чем у других 
ионных помп, и в большинстве случаев содержит только одну 
каталитическую субъединицу. Трансмембранный домен 
представлен десятью спиралями, причем и N- и С-концы по-
липептида обращены в цитозоль. АТФазы имеют регуля-
торные домены (в том числе автоингибиторные) на С-кон-
це молекулы и, по-видимому, места связывания с регуля-
торными белками, в первую очередь с белком 14-3-3 (акти-
вирующим разнообразные ферменты). Предполагается, 
что важную роль в активации Н
+
-
АТФаз играет их фосфо-
рилирование протеинкиназами, но, с другой стороны, обна-
ружена и их активация при дефосфорилировании.
Интересно, что работа Н
+
-
АТФаз плазмалеммы стимули-
ровалась Са
2+
-
активируемыми протеинкиназами [Schaller, 
Oecking, 
1999]. Если иметь в виду, что обычно под влиянием 
элиситоров происходит одновременное повышение содержа-

Рис. 34. Схема участия протонных каналов и помп в преходящем 
подкислении цитозоля

жүктеу/скачать 3,42 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: