Л. Х. Гордон доктор биологических наук, профессор

судить по изменению ультраструктуры: вакуолизации 
[Shirasu, Schulze-Lefert, 
2000] и съеживанию цитоплазмы, 
вздутиям ядерной оболочки, фрагментации ядер, конденса-
ции хроматина [Aoyagi et al.,1998; Gao, Showalter, 1999], уп-
лотнению матрикса митохондрий и т.д. Необходимо отме-
тить, что плазмалемма сохраняет свою целостность. Апопто-
зу подвергаются клетки, окружающие инфицированный учас-
ток, причем наибольшей восприимчивостью отличаются 
клетки, примыкающие к проводящим пучкам листьев. Апоп-
тоз и, вследствие этого, высыхание клеток создают механи-
ческий барьер для распространения инфекции по растению, 
в том числе системно по проводящим путям.
Принципиально важен вопрос о том, участвуют в про-
цессе апоптоза белки, уже имевшиеся в клетках до воспри-
ятия ими элиситора - сигнала смерти, или этот сигнал вы-
зывает экспрессию генов апоптоза с помощью сигнальных 
систем, и уже затем образовавшиеся протеазы, нуклеазы и 
другие ферменты апоптоза приводят к смерти клетки. 
Вторая возможность подтверждается тем, что процесс 
апоптоза подавляется при действии на клетки ингибиторов 
синтеза белков, например циклогексимидом. Известны ге-
ны, экспрессия которых приводит к апоптозу клеток у жи-
вотных и растений; он не происходит, если синтез белков 
подавлен с помощью ингибиторов [Greenberg, 1996; Mittler et 
al., 1997].
В исследовании процесса апоптоза все большую роль иг-
рают параноидные мутанты растений, образующие некро-
тические пятна самопроизвольно, без действия патогенов, и 
трансгенные растения с привнесенными генами апоптоза 
или генами ферментов, влияющих на содержание небелко-
вых соединений, принимающих участие в процессе апопто-
за, например интермедиатов сигнальных систем, таких как 
салициловая кислота.
Культура клеток - хорошая модель для изучения 
апоптоза [McCabe, Leaver, 2000], так же как трансгенные 
растения со спонтанным образованием апоптозных пятен 
без действия патогенов [Mittler, Rizhsky, 2000].
Исследования апоптоза вышли на новый, более высокий 
уровень после установления основополагающих фактов ге-
нетического контроля за протеканием апоптоза у нематоды 
Caenorhabditis elegans. 
Оказалось, что этот контроль осуще-
ствляется тремя основными генами: ced-3, ced-4 и ced-9 (аб-
бревиатура от С. elegans death). Первый кодирует каспазы, 
третий - белок-ингибитор каспаз, гомологичный белкам се-
мейства Вс1-2 (например, Bcl-xL) у млекопитающих. Для 
осуществления своих функций ингибитор каспаз нуждается 
в белке, кодируемом геном ced-4, действующим в качестве 
моста между каспазой и ее ингибитором. Существует и не-
сколько вспомогательных генов ced. Эндогенные белковые 
активаторы апоптоза - Bad, Bax и Bcl-X
s
, 
ингибиторы -
Вс1-2 и Bcl-X
L
.
Основной механизм апоптоза у животных и растений 
консервативен, но в геноме арабидопсиса отсутствуют мно-
гие гены, кодирующие регуляторы апоптоза, характерные 
для человека, червей, насекомых, что показывает, что рас-
тения используют и другие регуляторы для контроля над 
этим процессом [Lam et al., 2001]. В то же время обработка 
кеточной суспензии томатов химическими индукторами 
апоптоза животных клеток приводила к апоптозу и клеток 
растений [De Jong et al., 2000].
Очень важным этапом апоптоза является активация цис-
теиновых протеиназ - каспаз (сокращение от кальцийзави-
симых протеиназ). С помощью ингибиторного анализа по-
казано, что сериновые протеиназы не отвечают за развитие 
этих событий [Green,1998]. Гибель клеток затормаживалась 
под влиянием экзогенного ингибитора цистеиновых проте-
иназ [Vardi et al., 1999] и при активации экспрессии гена эн-
догенного белкового ингибитора цистеиновых протеиназ 
ISolomon et al., 
1999]. Еще один существенный этап апопто-
за - активация эндонуклеаз.
Растения имеют два основных класса ДНКаз: Zn
2+
- 
и 
Са
2+
-
зависимые, и оба принимают участие в процессе апоп-
тоза [Sugiyama et al., 2000]. Их активация приводит к фраг-
ментации ядерной ДНК [Mittler et al., 1997; Gao, Showalter, 
1999; Vardi et al., 1999; De Jong et al., 2000; Pedroso et al., 2000; 
Xu, Roossinck, 
2000]. Исследование апаптоза животных кле-
ток позволило установить, что существуют программы 
апоптоза и их начальными звеньями можно считать лиган-
ды (первичные сигналы) апоптоза - своеобразную "черную 
метку" и семейство рецепторов этих лигандов.
Эти события проявляются достаточно быстро, напри-
мер, фрагментация ДНК обнаруживалась через 12 ч после

Рис. 35. Схема участия кальциевой, липоксигеназной, НАДФН-
оксидазной и NO-синтазной сигнальных систем в процессе апоп-
тоза клеток
ГПО-ПЖК - гидропероксипроизводные полиеновых жирных кис-
лот; НАДФН-О - НАДФН-оксидаза; ФЛА
2
-
фосфолипаза А
2
;
ФЛС - фосфолипаза С; NO-S - NO-синтаза; Of - супероксиданион-
радикал; OONO" - пероксинитрит
воздействия перекиси водорода на протопласты из корней 
чечевицы, достигая максимальной величины еще через 12 ч 
[Maccarrone et al., 2000].
Имеются доказательства, что начальные этапы процесса 
апоптоза осуществляются с помощью сигнальных систем 
клеток растений, "включаемых" элиситорами или(и) токси-
нами патогенов. Об этом свидетельстуют, например, дан-
ные, что малые G-белки могут регулировать интенсивность 
процесса апоптоза [Kawasaki et al., 1999], так же как проте-
инкиназы и протеинфосфатазы.
Доказано, что основное участие в инициировании апоп-
тоза принимают такие сигнальные системы клеток, как 
кальциевая [Mittler et al., 1995; и др.], НАДФН-оксидазная 
[Mittler et al., 1998; 1999], NO-
синтазная [Pedroso et al., 2000; 
и др.] и липоксигеназная [Rusterucci et al., 1999; Maccarrone et
al., 
2000] (рис. 35). О последнем свидетельствует предотвра-
щение фрагментации ДНК при действии ингибиторов липо-
ксигеназ на клетки, осуществляющие Н
2
О
2
-
индуцируемый 
апоптоз [Maccarrone et al., 2000].
Имеются немногочисленные свидетельства участия в 
апоптозе МАР-киназной сигнальной системы [Suzuki et al., 
1999]. МАРК-каскад регулирует апоптоз. МАРКК располо-
жена выше SIPK и WIPK. У мутанта табака конститутивно 
экспрессируемая МАРКК индуцировала апоптоз [Yang et 
al., 2001].
NO 
независимо от АФК вызывал апоптоз у суспензии 
клеток арабидопсиса со всеми его атрибутами: конденсаци-
ей хроматина, каспазной активностью, а ингибитор каспаз 
блокировал апоптоз [Clarke et al., 2000].
Предполагается, что в апоптозе животных клеток мо-
жет принимать участие и аденилатциклазная сигнальная си-
стема [Северин и др., 2001].
Сигнальные интермедиаты перечисленных выше систем 
могут активировать предсуществующие в клетках фермен-
ты, а также инициировать экспрессию главных генов апоп-
тоза, кодирующих эндонуклеазы [Mittler, Lam, 1995; 1997; 
Aoyagi et al.,1998; Tada et al., 
2001] и протеиназы [De Silva et 
al., 1998; Solomon et al., 1999; De Jong et al., 2000; Tada et al., 
2001], в том числе представителей семейства каспаз, не 
только специфичных для животных объектов [De Jong et al., 
2000], но обнаруживаемых и у растений. Получены данные 
об элиситориндуцируемой экспресии генов белков, осуще-
ствляющих тонкую регуляцию процесса апоптоза [Polyak et 
al., 1997; Pontier et al., 1998].
Патогены или элиситоры могут не только активиро-
вать, но и затормаживать экспрессию некоторых генов, на-
пример, катал азы и аскорбатпероксидазы [Mittler et al., 
1998; 1999] - 
ферментов, принимающих участие в снижении 
уровня перекиси водорода в цитоплазме, что повышает со-
держание этого сигнального соединения и, возможно, явля-
ется определяющим в индукции экспрессии генов апопто-
за - эндонуклеаз и протеиназ. Кстати, накапливается все 
больше фактов экспрессии генов, вызывающих торможе-
ние развития апоптоза [Gallois et al., 1997; Gray et al., 1997; 
Tanaka et al., 1997; Mayda et al., 1999; Mitsuhara et al., 1999].
В активации предсуществующих ферментов на первом

этапе апоптоза (после рецепции клеткой элиситора - сигна-
ла смерти) важную роль играет кальциевая сигнальная сис-
тема в связи с тем, что основные ферменты, отвечающие за 
программируемую смерть клеток протеазы семейств каспаз 
и эндонуклеаз, - это кальцийактивируемые ферменты.
У животных одной из мишеней сигнального Са
2+
, инду-
цирующего апоптогенный сигнал, являются митохондрии. 
Обнаружено, что сигналы, приводящие к апоптозу, вызыва-
ют раннее, еще до появления первых ультраструктурных 
симптомов гибели клетки, повышение проницаемости внут-
ренней митохондриальной мембраны, одним из последст-
вий которого может считаться потеря митохондриями ци-
тохрома с [Северин и др., 2001]. В цитозоле он вызывает 
"включение" каскада каспаз, разрушающих топоизомеразу 
и гистон HI, который защищает ДНК от действия эндону-
клеаз на межнуклеосомальном уровне. Повышение кон-
центрации ионов кальция в цитозоле может привести так-
же к непосредственной активации Са
2+
, Mg^-
зависимых 
эндонуклеаз.
У растений освобождение цитохрома с тоже предшест-
вует морфологическим изменениям, связанным с апопто-
зом [Balk, Leaver, 2001]. Оказалось, что цитохром с индуци-
рует апоптоз только в окисленном состоянии. Высокий 
уровень цитоплазматического восстановленного глутатио-
на (GSH) поддерживает его в неактивном состоянии, а 
Н
2
О
2
, снижая содержание GSH, вызывает апоптоз [Hancock 
et al., 2001].
В целом ряде работ были получены свидетельства уча-
стия стрессовых фитогормонов салициловой кислоты, жас-
моновой кислоты и этилена в развитии процесса апоптоза. 
В опытах с использованием трансгенных растений арабидоп-
сиса с чужеродным геном NahG (что приводило к деградации 
салициловой кислоты), а также с мутантами, нечувствитель-
ными к жасмоновой кислоте или этилену, было обнаружено, 
что апоптоз медиируется сигнальными путями, включающи-
ми салицилат, жасмонат и этилен [Asai et al., 2000].
Этилен вызывал апоптоз [Mergemann, Sauter, 2000] -
фрагментацию ДНК, съеживание ядра [Herbert et al., 2001], 
у клеток табака в культуре. Тот же эффект вызывала обра-
ботка перекисью водорода [Houot et al., 2001]. Салицилат и 
этилен вовлечены в регуляцию апоптоза у арабидопсиса
[Greenberg et al., 
2000]. В отношении салицилата это было 
подтверждено в опытах и других исследователей [Heath, 
2000; Ludwig, Tenhaken, 2000].
Салицилат-опосредованная активация апоптоза у топо-
ля ингибировалась жасмоновой кислотой [Koch et al., 2000]. 
Существует большая литература о взаимодействии этих 
двух сигнальных метаболитов. Экзогенный салицилат, в за-
висимости от концентрации, может приводить как к апоп-
тозу, так и к антиоксидантным защитным путям. Озон 
вызывал апоптозный ответ через салицилатзависимый и 
независимый (жасмонатный и этиленовый) пути. Если ли-
стья тополя перед действием озона подвергались раневому 
воздействию или действию жасмоната, то уровень повреж-
дений был меньше. Озониндуцированное образование по-
вреждений (lesion) происходит двумя отдельными путями у 
двух клонов тополя. У устойчивого клона - это апоптоз, 
связанный со сверхчувствительностью, а у чувствительно-
го - некроз, вызванный потерей антиоксидантной защиты 
от активных форм кислорода.
На листьях трансгенного арабидопсиса с привнесенным 
геном NahG (салицилатгидроксилазы) было показано [Rao, 
Davis, 
1999], что смерть клеток наступает из-за неспособно-
сти поддерживать достаточный уровень антиоксидантной 
защиты.
Участие топоизомеразы в качестве одного из критиче-
ских звеньев осуществления апоптоза подтверждено с по-
мощью ингибиторного анализа. В суспензии клеток томата 
ингибитор топоизомеразы I камптотецин вызывал апоптоз. 
Каспазный ингибитор уменьшал эффект, а этилен - усили-
вал его [Orzaez et al., 2001]. Камптотецин вызывал также 
межнуклеосомальную деградацию ДНК у клеток культуры 
томата [Hoeberichts et al., 2001].
Использование трансгенных растений табака с привне-
сенными антиапоптозными генами человека Вс1-2 и Bcl-xl, 
а также нематодным геном ced-9 [Dickman et al., 2001] пока-
зало, что у них грибная инфекция не приводила к фрагмен-
тации ДНК, в отличие от контрольных растений.
В последнее время предпринимаются усилия для рас-
шифровки механизмов регуляции апоптоза, что может 
иметь и большое практическое значение для изменения ус-
тойчивости растений к патогенам.

жүктеу/скачать 3,42 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: