Методы стерилизации при проведении работ с культурой изолированных клеток и тканей растений
жүктеу/скачать 250,5 Kb.
|
| Объяснение. Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы: азот, фосфор, калий, кальций, серу, магний, железо; микроэлементы: бор, цинк, медь, марганец, кобальт, йод, молибден; витамины: тиамин (В1), пиридоксин (В6), никотиновая кислота (РР), а также углеводы и фитогормоны. Некоторые питательные среды включают гидролизат казеина, аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток в широких пределах рН.
Углеводы являются незаменимыми компонентами питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей, так как в большинстве случаев последние не способны к автотрофному питанию. Чаще всего в качестве источника углерода используют сахарозу или глюкозу в концентрациях 20 – 40 г/л. Полисахариды, как правило, не применяются, но поскольку некоторые ткани, например опухолевые, содержат активные гидролитические ферменты (амилазу). Они могут расти на средах с растворимым крахмалом. Гормоны необходимы для дедифференцировки клеток и индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины (вызывающие клеточную дедифференцировку) и цитокинины (индуцирующие деление дедифференцированных клеток). В случае индукции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов должно быть снижено или они могут быть полностью исключены. На средах без гормонов растут опухолевые и "привыкшие" ткани. Автономность по отношению к гормонам связана со способностью этих клеток продуцировать эндогенные гормоны. В качестве источников ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индолилуксусную кислоту (ИУК), индолилмаслянную кислоту (ИМК), нафтилуксусную кислоту (НУК). ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. Для индукции каллуса обычно необходимы высокие концентрации ауксинов (чаще это 2,4-Д), при последующих пересадках их уменьшают. В качестве источника цитокининов в искусственных питательных средах используют аденин, кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин, 2-ip. 6-БАП, зеатин и 2-ip по сравнению с кинетином более активны в отношении поддержания роста изолированных тканей и индукции органогенеза. Кроме ауксинов и цитокининов, отдельные питательные среды включают гибберелловую кислоту (ГК). Присутствие ГК в среде не является обязательным, но в некоторых случаях она стимулирует рост изолированной ткани, способствует образованию более вытянутых побегов. Для индукции первичного каллуса и реже для поддержания его роста в питательную среду иногда добавляют растительные экстракты или соки. Наибольшей ростактивирующей способностью обладает кокосовое молоко - жидкий эндосперм кокосового ореха. Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар. Он представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Наименьшее количество нежелательных примесей содержит бактериальный агар (Bacto Agar). Обычно к среде добавляют 0,5 – 0,7% агара. С целью экономии времени растворы макросолей, микросолей, витаминов, фитогормонов готовят концентрированными, что позволяет многократно их использовать. Концентрация растворов макросолей должна быть больше необходимой в 10 – 20 раз, микросолей – в 100 – 1000 раз, витаминов – в 1000 раз. Маточные растворы хранят в холодильнике, причем для хранения витаминов и фитогормонов нужна отрицательная температура. Для культивирования клеток, тканей и органов тех или иных растений используют питательные среды различного гормонального состава. Наиболее широко применяются среды Мурасиге-Скуга (табл.2), Уайта (табл.3), Гамборга и Эвелега (В5) ( табл.4). жүктеу/скачать 250,5 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|