«Өсімдіктер биотехнологиясы» ПӘннің ОҚУ-Әдістемелік кешені оқУ-Әдістемелік қҰжаттар жиынтығы семей,2013 Мазмұны

Протоплас – ферменттердің әсерімен немесе механикалық әдістермен қабығы түгел жойылған өсімдік жасушасы. Ағылшын ғалымы Э.Кокинг 1960-шы жылдардың басында жасушаның ішіндегі протопласты зақымдамай тірі күйінде бөліп алу әдісін жете зерттеп дайындады. Ол қызанақ тамырларының ұштарын, зең саңырауқұлақтар өсірген ортасына бөліп шығарған гидролиздік ферменттерімен өңдеп, протопластарды ферменттік әдісімен бөліп алды.

Әдетте тірі жасушада протопласт жасушаның қабырғасына орталық вакуольдің тургор, яғни кернеулік қысымымен тығыз жанасып тұрады. Жасуша қабығы арқылы плазмалеммамен қоршалған цитоплазмалық жіңішке жіпшелер өтеді, солар арқылы көршілес жасушалардың протопластары біріне-бірі жалғасып жатады. Сондықтан жасуша қабығын ферментпен еріткен кезде протопластарға зиян келтірмей жасушаларда плазмолизді жұргізеді. Осмотик ретінде сахароза, маннит, сорбит қолданылады. Осы заттардың гипертониялық ерітінділері әсерінен вакуоль сусызданып жиырылып, протопласт көлемі кішірейіп, соңынан қабықтан алшақтайды. Кейде жасуша сопақ болғанда протопласт плазмолиз кезінде екі бөлініп кетууі мүмкін. Сондай ядросы жоқ субпротопласт цитопласт деп аталады.

1968 жылы жапон ғалымы Такебе темекі жапырағының мезофилл жасушаларынан протопластарды көп мөлшерде алудың тиімді әдісін жете зерттеп дайындады. Алдымен жапырақты 70%-тік этанолда стерильдейді, кейін 15-20 мин 10%-тік кальций гипохлоритінде ұстап, дистильденген суда шайып алады. Астыңғы эпидермисті алып таста, жапырақты майда бөліктерге кесіп, пектиназа ферментінің ерітіндісіне салады. Пектиназа жасушааралық қабаттың заттарын ерітеді, яғни мацерация өтеді. Одан кейін объект целлюлоза ферментінің ерітіндісімен өңделеді, бұл кезде целлюлозалық жасуша қабығы біржолата жойылады. Фермент ерітіндісіне осмостық зат қосылады. Осы әдіспен әр түрлі өсімдіктердің ұлпаларынан протопластар алынады. Қазіргі уақытта протопластарды бөліп алу үшін ферменттердің қоспасын пайдаланады. Бұл қоспаның құрамында ферменттердің үш түрі болатын пектиназалар, целлюлозалар және гемицеллюлозалар. Олар жасуша қабығының негізгі компоненттерін ыдыратады. Бұл ферменттерді кейбір бактериялар мен саңырауқұлақтар өздерін өсірген сұйық ортаға бөліп шығарады, сонымен қатар оларды ұлудың асқорыту сөлінен бөліп алады. Қазіргі уақытта пектиназалық және целлюлазалық әсері бар бірталай стандарттық ферменттер бар.

Ферменттік ерітінділерді арнайы сүзгіден өткізу арқылы залалсыздандырады. Жасуша түрлерінде құрылымы мен құрамы жағынан айырмашылықтары болғандықтан, қоданылатын ферменттердің комбинациялары мен мөлшерінің ара қатынасы бірдей болмайды. Әрбір ұлпа үшін ферменттердің құрамы, концентрациясы мен ара қатынасы және өңдеу уақыты бөлек іріктеліп алынады. Бөлініп алынған протопластар ферменттік ерітіндіде мейлінше аз уақыт болуы керек, одан кейін ұқыпты түрде жуылуы қажет.

Протопластарды бөлу кезінде аэрацияның маңызы зор. Сондықтан ортаны араластыратын жабдықтар қолданылады немесе ферменттік ерітінді түбіне ғана құйылған Петри табақшасында бөліп шығарады. Протопластарды ала көлеңкеде немесе қараңғыда бөліп алады. Ферменттік ерітіндіде инкубация уақыты ферменттердің үйлесуіне, рН және температураға байланысты, 1-2 сағаттан 15-16 сағатқа дейін барады. Әрбір нақтылы ұлпа үшін ең тиімді температурамен өңдеу уақытын жеке іріктеп алу қажет. Температура әр деңгейде болады, мысалы бидайға 14°С болса, қызанаққа 27°С.