Биотехнология
жүктеу/скачать 16,47 Mb. Pdf көрінісі
|
101 і Қосымша метаболизмді белгілейтін генетикалық ақпарат жүзе- ге асу үшін ерекше жағдайлар керек. Жасушалардың түріне тән ерекше заттарды синтездеу қабілетін жоғары деңгейде сақтау үшін генетикалық деңгейіндегі әрекеттер мен жасушалық сүрып- тауды қолданады. Ең жақсы өнімді штамдарды суспензияда өсіре- ді, яғни қатты ортада алғашқы шыққан каллустар сүйық ортаға көшіріледі. Өсіру тәртібі өзгергенде штамм өзінің сапасын жоғал- тпауы керек, сондықтан ол стресс жағдайларына төзімді болу керек. Жетінші кезеңде өнімді және түрақты штамдарды өндіріс жағдайына жақын көлемдері жүйелі кеңейтілетін ферментерлерде иммобилденген түрде өсіреді. Егер иммобилденген жасушалар осындай жартылай өндіріс жағдайында өсу қарқындылығьга сақ- тап және қажетті заттың синтезін, жинақталуьш және оньщ ор тага бөлініп шығуын өзгертпесе, бүндай штамды ірі масштабтық ондірісте пайдалануга болады. Сонғы кезеңде жасушалық био- массаны алады және оны багалаудың техникалық регламентін (іс тәртібін) жасайды. Иммобилденген жасушаларымен қатар инженерлік энзимоло- гия көмегімен иммобилденген ферменттерді пайдаланады. Иммо билденген ферменттерді автомат анализаторда қолдану, көп рет көлемді сынамалардың талдауын жүргізуге және көп көлемді сүй- ықтықтар ағынының көрсеткішін үздіксіз тіркеуге мүмкіндік бе- реді. Әртүрлі өндірісте төменде ферменттердің иммобилденген түрдегі препараттарын кең пайдаланады: — крахмалдан глюкозалық сироп алу үшін амилазаны; — глюкозаны фруктозаға изомерлеу үшін глюкоизомераза; — жеміс-жидек шырындарын жарықтандыру пектинметилэс- теразаны; — инверттік қант алу үшін инвертазаны; — казеин гидролизатынан және алынған сүт ақуыздарын үздіксіз коагуляциялау үшін пепсинді; — антибиотиктердің модификациялану реающяларын катализ- деУ үшін пенициллинамидазаны және тағы басқа ферменттерді қо^анады . \^ Т ө м е н сатыдагы өсімдіктер - балдырлар - көптеген биология- льгкГбелсенді қосьшыстардың көзі болып табылады. Мысалы, спи- рулинада (Зрігиііпа зр.) ет өнімдері, бүршақтүқымдас және түрлі жарнақтарга қарағанда В, витамині әлдеқайда жогары. Қүрамын- дагы В 2 витамині бойынша жануартектес өнімдерді де артта қал- дырады. РР витамині бойынша спирулина қара малдың бауырын, 102 бүйрек, тіл, қүс пен қоян етінен біршама жоғары, ал фолацин бойынша ол бауыр, бүйрек, ірімшік секілді тағамдарды да артта қапдырады, олардың қүрамындағы фолациннің 90%-ы тағамдық өңдеуден өткен кезде жогалтатынын ескерсек, спирулинаның таби- ғи түрде пайдалануының өлдеқайда эффективті екенін көрсетеді. 'ф [^Спирулина қүрамында үш бояғыш-пигмент бар: каротиноид- тар, хлорофилл және фикоцианин. Жапон және америка дәрігерле- рімен өткізілген зерттеулер фикоцианиннің ағзаның лимфалық \ л оелсенділіпн жоғарылататынын және иммунды жүиесін күшеи- тетінін көрсетті. Көк-жасыл балдырдан Сһіогеііа $р., ашытқы- лардан ( Кһосіоіогиіа зр.), актиномицеттерден (.Асііпотусез зр.), мукорлық өңез Віакезіеа ігізрога-дгм каратиноидтарды алады. Әсіресе, {5 -каротин - тағам өндірісінде кең пайдаланылатын пиг мент?? 3.2.2. Жасушалық инженерия Ауыл шаруашылығында мәдени өсімдіктердің жаңа сортгарын алу үшін жасушалық инженерияны, гендік инженерияны, жасуша- лық селекцияны қолдананды. Ал селекциялық үдерісті жылдамда- ту, жеңілдету, сонымен катар сауықтырылған вируссыз өсімдік- терді көбейту үшін гаплоидтық технологиямен микроклондық кө- оеиту технологияны паидаланады. [Жасушалық инженерияны қолданып түпкі тектері алыс жатқ- ан өсімдіктерді будандастырьш асимметриялық будандарды және цитоплазмалық гендері жағынан гетерозиготаларды алуга бола ды. Жасушалық инженерия арқылы өсімдіктердің жаңа формалар - сомалық будандар - алынады. Протопластар - жасуша қабық- шасыз жасуша § белгілі жағдайда бірімен-бірі қүйылысып қосы- лып будан жасушасын түзеді, сол жасушадан кейін будан өсімдік пайда болады. Протопластарды алу үшін өсімдік жасушада плаз молиз қүбылысты ьгаталандырып, жасушаны целлюлозо-пектинді қабықшаны ыдырататын ферменттермен өңдейді ( 21-сурет ). Протопластарды қосу арқылы будандастыруды әртүрлі атай- ды: сомалық будандастыру, парасексуалъды будандастыру, жыныстык, емес будандастыру, ал пайда болтан буданды - сома- лык, будан деп атайды. Протопластар күйылысқанда алдымен олар бір-біріне тогысып жабысады, оны агглютинация деп атайды. Со- дан кейін олардың мембраналары да қосыльт, екі протопластан үлкен бір протопласт пайда болады/ 103 А В 21-сурет. Плазмолизге үшыраған өсімдік жасушасы (А) және ферментативтік гидролизден кейін пайда болтан протопласт (В) Протопластарды нәтижелі бөліп алу көптеген факторларга байланысты, мысалы: 1 ) үлпаның шығу тегі (жапырақ, түқымжарнақ, тамыр, тозаң түйіршіктері, каллус үлпасы, суспензиядағы клеткалар); 2 ) өсімдіктің түрі мен сорты (оның генотипі); 3) өсімдіктің физиологиялық күйі; 4) ферменттердің қүрамы және олардың сапасы; 5) ортаның рН және осмостық заттың түрі. Протопластардың тіршілікке икемділігін, яғни олардың мета- болиттік белсенділігін анықтайтын арнайы әдіс бар, ол протопла- стардың флуоресцеиндиацетатпен (ФДА) боялуы. ФДА - бүл флу- оресценциясы жоқ қосылыс, протопластардың мембранасынан жеңіл өтеді. Тірі протопластардың ішінде фермент эстеразаның әсерімен ьщьфайды, соның нәтижесінде флуоресцеин босайды, оны протопластардың бүтін мембраналары үстап қалады. Сон- дықтан метаболиттік белсенділігі бар (яғни тіршілікке қабілетті) протопластар ультракүлгін сәулесінде көзге көрінеді, себебі іште- рінде жннақталған флуоресцеин ультракүлгін сәулесімен қозды- рыльш, жасыл сәулені тарата бастайды. Протопластарды суйык, ортада өсіргенде олардың тығыздығы жоғары болуы керек. Көбінесе бүл көрсеткіш 1мл 104— 10 5 жасуша болады. Протопластарды өсірудің кең таралған әдісі, оларды жо- 104 ғары ылғалдылықта көлемі 20-40 мкл тамшыларда өсіру. і у / о жылы украин ғалымы Ю.Ю.Глеба жеке протопластарды қоректік ортаның көлемі 1 мкл дейін микротамшыларда өсіру әдісін жете зерттеп дайындады және өзінің зертгеу жұмысында осы әдісті қолданды. М.Ә. Айтхожин атындағы Молекулалық биология және VI.Қ. Қарабаев пен Ж.Қ. Жардемалиевтың институтында сомалық ұлпаларынан алынды ортада да өсіруге болады. Ол үшін протопластар суспензиясын — « _ _ — А Ш * М араластырады Орта суып қатқан соң оның ішіндегі протопластар бір-бірінен алыстау электр дықтан олар суспензияда бір-бірінен оқшауланады. Құйылысу үшін оларды алдымен бір-бірімен жанастыру керек, сондықтан плазмалемма зарядын өзгерту қажет. Протопластарды қүйылы- суы үшін химиялық және электрлік әдістерді пайдаланылады. Химиялық әдіс протопластардың қүйылысуына жағдай жасайтын, плазмалемманың электрлік зарядын өзгертетін затгарды, мысалы полиэтиленгликолды, суспензияға қосуға негізделген. Осы әдісімен 10 %-тен астам (тіпті 50% дейін) протопластарды қосуға болады ( 22-сурет ). Полиэтиленгликоль (ПЭГ) қосылғанда протопластар дегидратация арқасьшда бір-біріне жабысады ( 22а,б-сурет ). Сус- ж.', к А. 41 мм ^ “ Ч < ” Я Ж ‘ қабатты браналардың мембранамен оңай құйылысады ( 22в-сурет ). Мүмкін ПЭГ су ор- а протопласт 22-сурет. Протопластардың ПЭГ-тің әсерімен қүйылысуының кезеңдері 105 тасының полярлығын төмендетеді, соның нәтижесінде мембра- наның полярлық және гидрофобтық компоненттері қайта бөлініп, липидтік құрылымдары тұрақталады. ПЭГ-тың әсерімен мембрана көп жерден тесіледі. Протоплас тар бір-бірімен жабысқан кезде, сол тесіктер арқылы олардьвд ішіндегі заттары ары-бері өтеді. Протопластар қосылғаннан кейін де, ең бастапқы кезеңде мембраналардағы тесіктер бітелмейді. Протопластар әбден толығымен қосылған соң ғана олардың мем- браналары құйылысып жалпы ортақ бір толық плазмалемма бу- Дан протопласты қоршайды. Ақырында протопластар дөңгеленіп будан протопласт пайда болады ( 22г,д-сурет ). Электрлік цүйылысу әдістің негізінде электр өрісі пайдалана- ды. Протопластар суспензиясы екі электродтың арасьгада орна- ласады ( 23а-сурет ). Айнымалы ток диэлектрофорезді қоздыра- ды, протопластар бір-біріне тақалып бір қатарға тізіледі (236- сурет). Бұл тізбектер тек электр өрісі болған кезде тұрады. Олар- ға қосымша жеке қатты электр импульсін (600 В/см, 10-20 мксек.) бергенде ( 23в-сурет ), қатты қысылып тұрған плазмалық мембра- наларда тесіктер пайда болады да, протопластар бір-біріне қүйы- лып кетеді (23г,д-сурет). Электр өрісінің әсерінен протопластар бөлме температурасьшда және рН-тың физиологиялық мөлшері- нде нәтижелі қосылады. Қысқа қатты импульс мембранаға қысым жасап, протопласт плазмалеммалары қосылып тұрған жерде диэ- лектрлік бұзылуға себеп болады. Өзгеріліп тұрған электр өрісі Будан протопласт Будан протопласт одтар Уақыт а б в д 23-сурет. Электр өріс әсерімен протопластардың қүйылысуьіның кезендері (Уәлиханова Г.Ж., 2001 ж.) 106 мембрана ақуыздарының латеральдік диффузиясына апарады, соның арқасында ақуыздары жоқ мембрананьтн учаскелері пайда болады. Сондай кезде қарама-қарсы түрған протопластар мембра- налары әрекеттесуі мүмкін. Бунда липид молекулаларымен алма су, липид көпірлері пайда болуы мүмкін, ақырында мембраналар күйылысады. Электр өрісі көмегімен әр түрлі үлпалардың және өсімдіктер түрлерінің протопластары қосылады. Екі протопласт қосылған кезде, егер олардын ядролары қосыл- са, нағыз будан жасуша, яғни ядролық будан пайда болады. Ядро лары қосылмаған будан жасуша гетерокарион деп атайды. Гете- рокарионды ата-аналық біреуінің немесе екеуінің субпротоплас- тарын будандастьфу үшін пайдалануға болады. Субпротопласт - протопластьщ бөлігі, цитоплазмалық мем- бранамен қоршалған қүрамында кейбір органоидтары бар прото пласт; ядросы болса, ол - нуклеопласт, ядросы жок болса, ол - цитопласт, ядро мен цитоплазманың бөлігі болса, ол - мини-прото пласт. Хлоропластар мен митохондрияларды бір жасушадан екін- шісіне көшіру үшін цитопластарды пайдалануға болады. Ата-ана- ның біреуінің ядросы бар және цитоплазмалық гендерді екеуінен немесе біреуінен болса, онда цитоплазмальщ будан ( цибрид) деп аталады ( 24-сурет ). Ата-аналық біреуінен цитоплазмальщ гендері иеленген будан- дарды цитоплазмалық гетерозиготалық будан (цитогет) деп атайды. Жасушада цитоплазмалық гендер хлоропластар мен мито- хондрияларда болғандыктан және кейбір ядролық және цитоплаз- малық гендері жойылу (сегрегация) арқасында, сомалық будан дастьфу нәтижесінде будандардьш 27 түріне дейін алуга болады. Сонымен сомалық будандастырудың артықшылыгы мьгаада: • әдетте жыныстық жолмен будандаспаитын тектер алыс-жа- қьга түрлерді будандастыру; • ассиметриялық буданды алу, оларда аналық немесе аталық- тарының гендерінің жиынтығы толыгымен болса, сомалық бу- данда бірнеше хромосомасы болса жеткілікті; • сомалық буданда үш немесе оданда көп, ата-аналық жасу шаларды қосуға болады; | ядродан тыс цитоплазмалық гендері бойынша гомозигота- ларды алу; • жыныстық жолдармен көбейе алмайтын түрлердің сортын алу. 107 Жынысіық будандастыру Сомалық будандастыру Ядролық будан Г етерокарион Цитоплазмалық будандар Сомалық будандастыру Цитопласт Протопласт Г етерокарион Цитоплазмалық геномның сомалық будандастыру кезіндегі сегрегация нэтижесінде пайда бола алатын Цитоплазмалық 24-сурет. Сомалық будандастьфу барысында ядролық (дөңгелек) және цитоплазмалық (сопақ) белгілерінің тұқым қуалаушылығын көрсететін үлгісі (Уәлиханова Г.Ж., 2001 ж.) 3.2.3. Гендік инженерия Өсімдіктер қоршаған ортаның көптеген қолайсыз факторла- рының әсеріне: жоғары және төмен температура, ылғалдың жетіс- пеушілігі (құрғақшылық), топьфақтың тұздануы (сор топырақ), ауаның газдануы, минералдық заттардың жетіспеушілігі немесе, керісінше, шектен тыс көбеюі т.с.с. тап болады. Бұл факторлар өте көп болғандықтан олардан қорғану жолдары да әртүрлі - 108 физиологиялық қасиеттерден құрылымдық өзгерістерге дейін. Өсімдіктің қандай болмасын стресс факторына төзімділігі көпте- ген гендерге байланысты. Сондықтан, өсімдіктің бір түрінен екінші түріне барлық төзімділік белгілерін толығымен тасымалдап еңгі- зу тек қана бір әдіспен әрине мүмкін емес. Кейбір жағдайда гендік инженерия арқылы өсімдіктердің төзімділігін арттыруға болады. Мысалы, абиотикалық факторларына өсімдіктің метаболитгік ре- акциясын бақылайтын жеке гендермен әрекеттер жүргізуге жағдай бар. Қоршаған ортаның жағдайларына жауап реакцияларының физиологиялық, биохимиялық, генетикалық негіздерін, одан әрі зерттеулер гендік инженерия әдістерін колданып, төзімді өсімдік- терді шығаруға мүмкіндік береді. Генетикалық өзгерілген немесе генетикалық модификацияланган өнімдер - бұл ДНҚ-на ерекше табиғаттан берілмеген ген енгізілген өсімдіктерден алынған өнімдер, оның арқасында олардың бойында әртүрлі жаңа қасиет- тер пайда болады. Г ГӨсшдіктердің жаңа турлерін жасауда уш кезеңді бөледі Гіірінттті птфугтпргп ^ааразиттерге немесе гербицидтерге қандай да бір жаңа тұрақтылық касиеті бар өсімдіктерді жасау. Бірінші кезеңде өсімдіктің түрлерін жасауда салыстырмалы шаншаң жетістік енгізілген тұрақтылық касиеті бір генмен айқындалаты- нымен түсіндірілді, ал гендер көзі өсімдіктердің вирустары неме се топырак бактериялары (жәндіктерге, гербицидтерге түрақты- лықты кодтайтын гендері) болды. Бірінші кезекте - бұл майлы дакылдарында өзгертілген май күрамы, сондай-ақ қүрамында витаминдері көп жеміс пен көкөніс, күнарлығы жоғарьшатылған бидай дақылдары және т.б. Екінилі кезең - жаңа агрономдық қасиеттері бар өсімдіктерді жасау. Бүгінде әлемнің жетекгаі зерт- ханаларында үшінші кезеңнің өсімдіктері жасалуда және таяудагы он жылда олардын нарыкқа шығуын күтуге болады. Кейбір қаги- дағы бағыттар туралы сөз козғасақ: осімдіктер - вакциналар, плас- тиктің әртүрлі түрлері, бояуыштар (мысалы, индиго), техникалык майлар және қозғауыштарға арналған қондьфғылар секілді индус- триялы өнімдерді өндіру жөніндегі өсімдіктер - фабрикалар^ ^ I Гендік инженерия әдісі көмегімен бактериялардың геномына жаңа гендерді плазмида арқылы яғни сақина тәрізді біртізбекті ДНК арқылы енгізуге болады. Будандьщ плазмидаларды, яғни қүра- мында бізге қажетті генмен болатын плазмидаларды, Е.соіі дақыл- дарына қосады. Бактерияларда плазмида сіңіп ген ретінде қызмет етеді, сонымен қатар плазмида бактериялык жасушаларда көбеиіп 109 тор ретінде агрооактерия плазмидалар, хлороплас- тық жэне митохондриялык ДНҚ, жылжымалы генети- кейін рекомбинантты қ ДНҚ-ы өсімдіктердің тірі жасуш асына ен гізіл еді. Жаңа геннің экспрессиясы өтеді де, жасуша бөтен ген оелгілеитін ақуызды жаңа акуыздың синтезін қамтамасыз етеді. Одан Рекомбинантты плазмида ------------------ ■ —----------------------------- калық элементтер, вирус- 25-сурет. Бактериадды Ті-плазмидаға тар қолданылады ( 25-су- ту үшін оған басқа өсімдіктің қор ақуызының генін енгізу жөнінде алғашқы әрекетті Д.Кемп пен Т.Холл жасаған. Олар бүршақтың басты қор белогы фазеолин генің Ті-плазмида көмегімен күнба- ғыстың геномына енгізген еді ( 26-сурет ). Ті-плазмида — бұл А^гоЪасіегіа іите/асіепз топырақты бакте- рияның плазмидасы және өсімдіктердің ісік ауруын қоздыратын (ағ. іитог іпАисіщ - ісік туғызатын) агент болып табылады. Бүл бактерия өсімдіктің жарақаттанған үлпасы аркылы жасушаға кіргенде өзінің гендерін бірге ала келіп, өсімдік геномына енгізе- ді. Соның салдарынан өсімдікті жаңа ақуыздарды синтездеуге мәжбүр еткізеді. Нәтижесінде бактерия гендерін қабылдаған өсім- дік жасушалары өте тез көбейіп, тамыр мойьшында (тамыр мен сабақтын арасында) ісік, бүлтық пайда боладыі Бүл инфекция үдерісі шын мәнісінде табиғи гендік инженерия. Ісік жасушала- рында сау жасушаларда болмайтын опиндер деген жаңа классқа жататын химиялык заттар табылды. Опиндер - ол аргинин амин кышқылының туындылары. Жақсы зерттелгендер: октопин - арги нин мен пирожүзім органикалық қышқылының туьпадысы, нопа- лин - аргинин мен Ц-кетоглутаратгың туындысы. Ауру туғызған бактерияның штаммына байланысты ісік жасушалары октопинді немесе нопалинді синтездейді. Осы заттарды өсімдік жасушалары пайдаланбайды, ал бактериялар көміртегі мен азотгың көзі ретінде енгізілген жаңа ген (Б. Глик, Дж. Пастернак, 2002 ж.) п р т \ 110 А В Бактериалды плазмида Өсімдік жасушасы Трансфор- мацияланған өсімдік жасушасы 1п у і і г о - т л т өсірілепн жасушалар А§гоЪасіегіит (ите/асіет бактерияның Т і -пл азмидасы (Т-ДНҚ учаскесімен, бактериалды хромосомасымен) ш г о . ' 1 1 / Т рансген ді ӨС1МД1К Трансформацияланған жасушаларынан пайда болтан регенерант-өсі мді к С А - А§гоЬасІегіит іите/асіепз топырақты агробактерияның Ті- плазмидасы өсімдік жасушаны зақымдаудың нәтижесінде пайда болған ісік; В I өсімдік жасушадағы агробактериялары; С - агробактериялардың Ті-плазмида көмегімен трансгенді өсімдікті алу 26-сурет. А. іите/асіепз агробактерияны гендік инженерияда қолдану Бактериялар ісіктерді туғызумен метаболизмін біраз өзгертеді. Өсімдік жасушапары тек бактерия- Т рансфор мацияланған жасушаларды ажырату 111 |