Химико биологическая серия 1 2014
ISSN 1811-184X. Вестник ПГУ
жүктеу/скачать 1,29 Mb. Pdf көрінісі
|
chimbiol 1 2014 (3) СТР 49
| ISSN 1811-184X. Вестник ПГУ
серия ХИМИКО - БИОЛОГИЧЕСКАЯ. 2014. № 1 44 45 Рисунок 1 – Результаты иммуноблотинга взаимодействия рекомбинантных форм белков Importin β1 и mTOR: 1 - myc-mTOR+ flag-
Из рисунка 1 видно, что белок mTOR взаимодействует с белком Raptor, который входит в состав mTORC1 и является консервативным компонентом данного комплекса. Кроме этого, видна четкая связь рекомбинантных форм mTOR и Importin β1, что говорит не только об их близком взаимодействии, но и о возможном участии mTOR в ядерном импорте веществ. К основным белкам, участвующим в импорте рибосомальных белков в ядро клетки, относится Importin β1. Так как нами установлена связь данного белка с mTOR, то в дальнейшем была проведена работа по изучению влияния mTOR на ядерный импорт рибосомальных белков. Для этого были использованы условия, влияющие на работу mTOR комплекса: аминокислотное голодание, ингибиторы РР242, Torin, Rapamycin и LY. В эксперименте использовалась клеточная линия MDA-MB-435. Воздействие ингибиторов и аминокислотного голодания проводили в течение 1 часа перед началом лизирования клеток. Анализу подвергались рибосомальные белки
Рисунок 2 – Результаты использования ингибиторов mTOR Данные представленные на рисунке 2 показывают, что использование ингибиторов mTOR влияет на импорт рибосомальных белков, при которых отсутствует связывание Importin β1 с рибосомальными белками RPL5 и
показывает значительную связь этих белков. Полученные нами данные показывают влияние киназы mTOR на процесс импорта рибосомальных белков, но механизм данного действия остается не выясненным. Дальнейшие наши исследования были направлены на установление прямой связи киназы mTOR с основными белками ядерного транспорта – белком импортером Importin β1 и регулятором ядерного импорта RanBP2. Для этого нами проведены работы по мутированию основных сайтов фосфорилирования вышеуказанных белков. Для проведения мутации ДНК, кодирующей белок Importin β1, были выбраны 6 основных сайтов: S108, S468, S617, S633, S853, T855. После проведения ПЦР, полученные продукты мутированной ДНК (рисунок 3) трансформировали в компетентные клетки E. coli штамма XL-10 Gold и нарабатывали препаративное количество ДНК. Рисунок 3 – Результаты ПЦР мутированной ДНК: 1,8 – маркер, 2 – мутант S108, 3 – мутант S468, 4 – мутант S617+S618, 5 – мутант S633+S634, 6 – мутант S853+T855, 7 – мутант Т855. После наработки ДНК проводили ее секвенирование и дальнейший анализ для доказательства наличия мутации в полученных ДНК продуктах (рисунок 4). |