90
ферменттеу кезінде дами алады [108]. C. thermocellum әлеуетті тұрғыда ҚБҚ ағзасы болуы мүмкін
болғанымен, трансформация тиімділігінің төмендігі және C. thermocellum-да бөтен ақуыздардың
табысты артық айқындалуын көрсететін жарияланымдардың жоқтығы сияқты мәселелер изобутанол
сияқты синтетикалық биоотын алу үшін осы ағзаның технологиялық ілгерілеуін едәуір қиындатады
[109].
Биоотын өндіру тәсілдерінің бірі – алдымен тығыз байланысты, неғұрлым қолайлы ағзада
метаболизмнің қалаған жолдарын орнату және оңтайландыру. Қандай гендерді артық айқындау,
мутациялау және/немесе жою керектігі сияқты өзіне тән ерекшеліктерді анықтағаннан кейін, сол
стратегияны С.thermocellum үшін бейімдеуге болады. Clostridium cellulolyticum, бастапқыда
ыдыраған шөптен бөлінген [110], метаболизмдік инженерия бойынша осы бастапқы жұмысқа
пайдалы кандидат болып табылады, себебі ол сондай-ақ 16s РНК филогенетикалық талдау негізінде
Clostridium III тобының мүшесі болып табылады [111]. Басқа артықшылығы – оның мезофильді
сипаты, ол оларды қоршаған жылу сүйгіш ақуыздардың гетерологиялық айқындалуымен
байланысты. Сонымен қатар, C.cellulolyticum генмен (ГенБанкі, инвентар. NC_011898.1) және ол
үшін ДНҚ-ны тасымалдаудың жақсы дамыған әдістері [112] және гендердің аса айқындалу әдістері
бар [113]. Өзі ҚБҚ әлеуетті ағзасы бола отырып, Cellulolyticum С. thermocellum ұқсас целлюлозаны
ғана емес, сондай-ақ ксилозаны, арабинозаны, фруктозаны, галактозаны, маннозаны және рибозаны
қоса алғанда, гемицеллюлозаны ыдырату кезінде бөлінетін қосымша қантты пайдалана алады [114].
Бұрын C. cellulolyticum этанол өндірісін жақсарту үшін генетикалық тұрғыда түрлендірілген болатын
[113]. Сол сияқты, ҚБҚ ағзасын құруға қатысты зерттеулердің көпшілігі этанол өндірісінде
шоғырланған.
Осыған қарамастан, изобутанол сияқты жоғары спирттер (яғни екі көміртегі атомынан артық
спирттер) бензинді алмастыру үшін ең жақсы кандидаттар болып табылады, өйткені оларда энергия
тығыздығы, октандық саны және бензин қасиеттеріне ұқсас болып табылатын Рейд бу қысымы бар
[115]. Изубутанолдың этанолдан айырмашылығы, ол бензинмен кез келген қатынаста немесе
өзгеріссіз араласуы мүмкін, заманауи қозғалтқыштарды тәікелей қолданылуы мүмкін [116].
C.cellulolyticum, метаболизм көзқарасы тұрғысынан изобутанол өндірісі үшін өзгертілген. Валин
биосинтезінің өзгертілген жолын пайдалана отырып, пируваттың изобутанолға түрлендірілуін
басқаратын ферменттерді айқындау арқылы, біз кристалды целлюлозада өсетін C. cellulolyticum
пайдалана отырып, 660 мг/л дейін изобутанол ала алдық. Атап айтқанда, біз осы микроағзаларды
пайдалана отырып, кристалды целлюлозадан шамамен 660 мг/л изобутанолдың алғашқы өндірісін
растадық [117].. Пируваттан изобутанол өнімін тікелей алу үшін B.subtilis - тен
ацетолактатсинтазаны, ацетогидроксик қышқыл изомероредуктазасын, Е.Сoli – ден дигидроксик
қышқылының дегидратазасын және кетоқышқылды декарбоксилазасын, Lactoccus lactis спиртінен
дегидрогеназасын кодтайтын гендер pAT187 плазмидасының туындыларына клондалған (5.4 –
суретін қараңыз) [118]. Бұл ерекше гендердің таңдалынып алынған себебі – бұл гендердің E.coli – де
[119] және Synechococcus elongatus – те [120] изобутанолды өндіру үшін дәл сол гендердің
қолданылуы. Гендердің әртүрлі комбинациялары тұрақты ферродоксинді (Fd) Clostridium
pasteurianum жеделдеткішімен басқарылатын бірыңғай синтетикалық оперон түрінде клондалған.
Изобутанол жолындағы алғашқы үш ферменттердің белсенділігі C.cellululolyticum-да alss немесе alsS
ilvCD айқындайтын плазмиданы трансформациялау арқылы зерттелді. В то время как C.
cellulolyticum был успешно трансформирован с помощью пустого вектора, но трансформанты C.
cellulolyticum alsS или alsS ilvCD не были получены. C. cellulolyticum бос вектор арқылы сәтті
трансформацияланғанда, C. cellulolyticum alsS немесе alsS ilvCD трансформанттары алынбаған
болатын. Осындай нәтижелер бірнеше рет түрлендіруден кейін де байқалды. AlsS және alsS ilvCD
трансформанттарының алынбауына байланысты, изобутанолдың толық жолы зерттелді. C.
cellulolyticum трансформировали плазмидой, экспрессирующей alsS ilvCD kivd adhA. C. cellulolyticum
– ді Аlss ilvCD kivd adhA айқындауыш плазмидамен өзгертті. Трансформация пайда болған кезде
плазмида дәйектілігінің растамасы alsS бірізділігінің өзгермеген түрінде анықталмаған адениннің
жалғыз ендірмесінің б.т. 54 кезінде анықталғанын
көрсетті, ATG үдерісі басталғаннан кейін. Бұл дара
ендірме, оқу шеңберін жылжыта отырып, төмен тұрған мезгілсіз тоқтату – кодонының (TGA) және,
37 амин қышқылынан сіңірілген ақуыздың пайда болуына әкеледі. АlsS (* alsS) – ғы
бұл кенет өзгеріс
клондау үшін қолданылатын E.Сoli штаммынан пайда болғаны анықталды. AlsS жүйелілігінде
шеңбердің жылжу өзгерісі AlsS белсенділігіне тигізуі мүмкін әсерден қатты алаңдаушылық тудырды.
Осылайша, синтетикалық опероннан айқындалатын AlsS және басқа да ферменттердің
белсенділігін анықтау үшін C.cellulolyticum штаммының лизатасында * alsS ilvCD kivd adhA
айқындаушы ферменттік талдаулар жүргізілді.