Белки теломерного комплекса у человека

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
63
Рис. 25. Схема строения t-петли и белков TRF1,2 у человека
Белок ТRF2 был найден в конце 90-х годов. По структуре он сходен с ТRF1, но ТRF
домен последнего не взаимодействует с гомологичным доменом второго представителя дан-
ного семейства, так что оба белка в клетке могут существовать в виде гомо-, но не гетеро-
димеров. У ТRF2, как и у ТRF1, в результате альтернативного сплайсинга образуются два
варианта. На теломерах белок ТRF2 связывается в существенно меньшем количестве, чем
ТRF1. С помощью электронной микроскопии была уточнена область теломеры, в которой
концентрируется этот белок. Оказалось, что ТRF2 расположен в узле, образующемся в точке
касания однонитевого G-конца теломер со «стволом». Тогда же впервые было обнаружено,
что подавление ТRF2 может приводить к активации АТМ/р53-зависимого пути ответа клетки
на повреждение ДНК и затем к апоптозу, поскольку незащищенные t-петлей (развернутые)
концы хромосом подобны двунитевым разрывам ДНК и так воспринимаются клеткой.

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
64
Теломерные петли были обнаружены на хромосомах клеток НеLа, периферических
лейкоцитов человека, первичных клеток печени мыши, а также на теломерах трипаносом и
на микроядерных, но не макроядерных хромосомах инфузории Oxitricha. Размеры t-петель в
клетках человека составляют от 5 до 40 тпн. У трипаносом t-петли сравнительно небольших
размеров, около 1 тпн, хотя теломеры у этих простейших и у человека сравнимы по длине.
По-видимому, это минимальные размеры t-петель, обнаруженных на сегодняшний день.
Для связывания ТRF2 на конце хромосомы необходим однонитевой участок теломер-
ной ДНК длиной не менее одного повтора из шести нуклеотидов ТТАGGG. Наличие более
одного повтора в однонитевом участке улучшает связывание. Добавленный в избытке этот
белок связывается на теломерах в количестве не менее трех, а в среднем около десяти диме-
ров.
Предполагают, что в этом участке 3'-концевая однонитевая ДНК гибридизована с анти-
параллельной нитью частично расплетенной двойной спирали «ствола», так что образуется
так называемая d-петля (displacement 1оор), или соединение подобное структуре Холлидея.
Строение t-петли подробно показано на рис. 26.
Открытие и изучение теломерных белков дало дополнительную информацию о роли
теломер в регуляции клеточного старения.
В функциональных исследованиях белков ТRF выяснилось, что резкое увеличение
концентрации ТRF1 при его экспрессии под вирусным промотором в культуре клеток при-
водит к преждевременному вступлению в митоз и последующей гибели клеток. В аналогич-
ных условиях ингибирование ТRF1 в клетках, экспрессирующих теломеразу, сопровожда-
ется медленным увеличением длины теломер. Очевидно, ТRF1, способствуя образованию t-
петли, тем самым препятствует удлинению теломер за счет теломеразной активности.
Рис. 26. Строение t-петли у человека
Совсем иначе проявляются последствия экспериментального воздействия на белок
ТRF2. Его подавление с помощью доминантно негативных делеционных мутантов приводит
к морфологическим изменениям в строении модельных клеток, напоминающим старение и
к индукции в них характерных для клеточного старения молекулярных маркеров, а также к
немедленному и необратимому прекращению пролиферации. Концы хромосом в этих клет-
ках часто сливаются концами и образуют кольцевые структуры, хотя и не теряют теломер-
ные повторы. Одновременно на концах уцелевших теломер исчезают однонитевые участки,

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
65
хотя активность теломеразы не изменяется. Таким образом, не теломеры сами по себе защи-
щают хромосомы от нуклеаз, слияния и последующих разрывов при митозе. Это функция
белка ТRF2.
Увеличение концентрации ТRF2 в первичной культуре фибробластов сопровождается
некоторым возрастанием скорости укорочения теломер в ходе старения клеточной популя-
ции. В то же время этот эффект не приводит к преждевременному старению: напротив, в
ходе эксперимента клетки продолжают пролиферировать, когда контрольная культура уже
прекращает расти. Пороговая для репликативного торможения пролиферации длина тело-
мер у контрольных клеток составляет 6–7 тпн. У экспериментальной культуры, экспресси-
рующей большое количество ТRF2, эта точка на 2–2,7 тпн ниже, что позволяет им пройти
еще около 15 делений, прежде чем наступает старение. Более того, в клетках с критически
короткими теломерами, сенильных или мутантных по р53 и Rb, повышенная экспрессия
ТRF2 предотвращает слияния и разрывы хромосом. Полученные данные можно интерпре-
тировать следующим образом: не длина теломер важна для индукиии клеточного старения,
а их состояние, связанное с защитной функцией белка ТRF2. Например, сенильные тело-
меры могут быть недостаточно длинными для защиты конца хромосомы в узловой точке t-
петли, но когда концентрация ТRF2 повышена, то вероятность образования нормальной t-
петли возрастает.
Известно, что онкобелки некоторых вирусов позволяют соматическим клеткам пре-
одолеть пролиферативные барьеры и делиться бесконечно долго. В экспериментах на пер-
вичной культуре фибробластов было показано, что ингибирование ТRF2 не только приво-
дит к фенотипическим изменениям, характерным для старения, как это ранее наблюдалось
на клетках фибросаркомы, но также сопровождается характерными для старения генетиче-
скими изменениями. В частности, экспрессия доминантно негативного аллеля ТRF2 сопро-
вождается частым слиянием хромосом, формированием во многих клетках более двух цент-
росом и тетраплоидного кариотипа. После ингибирования ТRF2 в клетках активирован р53,
гипофосфорилирован Rb, увеличена концентрация р16 и понижен уровень циклина А, что
характерно для клеточного старения. Одновременная инактивация р53 и Rb при помощи Т-
антигена вируса SV40 и другими способами предотвращает старение экспериментальных
клеток, вызванное ингибированнем ТRF2.

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
66
Рис. 27.Роль t-петли в индукции клеточного старения и апптоза
Эти эксперименты вновь указывают, что белки р53 и Rb, индуцирующие старение,
могут быть активированы теломерами, когда те развернуты и не защищены белком ТRF2.
Схема взаимодействия этих белков представлена на рис. 27.
Интересно, что р5З имеет повышенное сродство к однонитевому участку теломер, к
узловому региону t-петли и даже несколько повышает вероятность образования t-петли в
присутствии ТRF2.
Уточнение состава теломерного нуклеопротеидного комплекса и выяснение роли тело-
мерных белков в индукции клеточного старения позволяет перейти к исследованию есте-
ственных регуляторов состояния теломер. Кроме уже известной теломеразы, за последние
годы было найдено еще несколько белков, которые могли бы играть подобную роль.
Хотя влияние ТRF2 на теломеры в условиях эксперимента проявляется наиболее
отчетливо, его модуляторы практически неизвестны. Лишь белок hRap1 (repressor-activator
protein) был недавно идентифицирован как партнер ТRF2, преимущественно связываемый
на теломерах, хотя он может также взаимодействовать с некоторыми другими участками
хромосом. Зато активность белка ТRF1, относительно мягко изменяющего длину теломер,
может регулироваться in vivo несколькими различными способами.
Например, ТRF1 может быть поли-АDР-рибозилирован, что сопровождается его дис-
социацией от ДНК. Эту посттрансляционную модификацию катализирует танкираза (тело-
мерная анкириновая полимераза поли-АDР-рибозы), белок, проникающий в ядро и в неак-
тивном состоянии связанный с TRF1. После активации танкираза подвергает поли-АDР-
рибозилированию себя и ТRF1, что приводит к распаду теломерного нуклеопротеидного
комплекса и высвобождению теломер. В результате теломеры становятся доступными для
теломеразы и других ферментов. Из-за этого танклразу считают позитивным регулятором
теломеразы.
У человека и позвоночных животных имеется два изозима танкиразы, несколько разли-
чающихся по молекулярной массе (142 и 127 кДа в немодифицированном состоянии), назы-

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
67
ваемые ТNKL или танкираза 1 и ТNKS или танкираза 2. Кроме энзиматического домена,
гомологичного соответствующему домену РАRР, у танкиразы имеется большой анкирино-
вый домен, состоящий из 24 повторов, а также SАМ-домен, участвующие в различных
белок-белковых взаимодействиях. У танкиразы 1 в отличие от танкиразы 2 имеется также
дополнительный N-концевой домен, функция которого до сих пор не ясна. Ни одна из тан-
кираз не имеет собственного сигнала ядерной локализации, поэтому большая часть фер-
мента находится в цитоплазме. Здесь танкираза подвергается фосфорилированию и актива-
ции МАР-киназой, хотя пока остается неясным, переносится ли активированный фермент в
ядро, или ядерный пул танкиразы активируется МАР-киназой, которая, как известно, сама
может быть транслоцирована из цитоплазмы в ядро. МАР-киназа через сигнальный путь
Ras-МАРК регулируется инсулином и факторами роста; поэтому следует предположить, что
с помощью танкиразы организм держит теломеры всех клеток под контролем гормонов.
Активность ТRF1 может быть увеличена за счет возрастания его концентрации, кото-
рая наблюдается на поздних стадиях клеточного цикла перед митозом. По-видимому, ТRF1
необходим для упаковки митотических хромосом, так как экспериментальное увеличение
его концентрации, как уже отмечалось выше, провоцирует преждевременный вход в митоз.
Для предотвращения вступления в митоз, например, когда ДНК нуждается в репарации,
ТRF1 может быть фосфорилирован протеинкиназой АТМ; той же самой протеинкиназой,
которая активирует р53 и индуцирует апоптоз и клеточное старение по р53-зависимому
механизму. Если в клетках больных АТ (у которых отсутствует активная АТМ) ингибировать
ТRF1, то они смогут поддерживать нормальную длину теломер, которые обычно укорачи-
ваются существенно быстрее, чем в клетках здоровых людей.
Недавно был найден еще один теломерный белок, взаимодействующий с ТRF1, кото-
рый получил название TINF2 или ТIN2 (ТRF1 intracting nuclear factor 2). Его молекулярная
масса около 40 кДа и по структуре он напоминает белки ТRF, так как на его С-конце также
расположен ДНК-связываюший домен типа Муb. Как и ТRF1, этот фактор способствует уко-
рочению теломер и негативно регулирует активность теломеразы. Например, если в кон-
трольной культуре иммортализованных фибробластов средняя длина теломер в ходе экспе-
римента через 43 удвоения популяции уменьшалась от 6,4 тнп до 5,7 тпн, то при высоком
уровне экспрессии TINF2 длина теломер падала до 5 тпн. В том же эксперименте ингибиро-
вание ТINF2 путем экспрессии его доминантно негативного мутанта, напротив, привело к
удлинению теломер до 9 тпн. Считается, что ТINF2 опосредует действие ТRF1.
Механизм действия ТRF1 на теломерах вряд ли заключается только в закручивании
ДНК в суперспираль и облегчении последующего образования t-петли, как было указано
ранее. Благодаря взаимодействию с множеством регуляторных белков, ТRF1 может концен-
трировать их в области теломер. В частности, ТRF1 связывает мощный ингибитор теломе-
разы, белок РinX1, который действует непосредственно на фермент, в отличие от остальных
ранее упоминавшихся модуляторов, влияющих на доступность субстрата теломеразы, т. е.
теломер. Совсем недавно был обнаружен еще один теломерный белок, связывающийся на ее
однонитевом участке, Роt1. Вероятно, функция этого 71 кДа полипептида состоит в защите
особенно уязвимой со стороны нуклеаз, облучения и химических агентов однонитевой ДНК,
чем и объясняется его название (рrotection of telomeres, РОТ). Роt1 взаимодействует с ТRF1.
Предполагают, что, влияя на связывание Роt1, белок ТRF1, концентрация которого пропор-
циональна длине теломер, передает на однонитевые концы информацию об общей протя-
женности теломерной ДНК.
Возможно, упомянутыми здесь белками список различных компонентов теломерного
нуклеопротеидного комплекса, называемого также телосомой, не исчерпывается. В следу-
ющем разделе будут приведены дополнительные данные, указывающие на наличие еще не

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
68
исследованных теломерных белков и белков, ассоциированных с теломерами структурно и/
или функционально.

жүктеу/скачать 2,57 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: