Тиімділігі жоғары сұйықтықты хроматография (ТЖСХ)

99
протеоманы бөлiкше бөлу алғанда екіншілік гель-электрофорез (2Д) 
қолданылады. 
Екіншілік гель-электрофорезін қолданғанда, белоктарды екі 
физикалық-химиялық қасиетке бөлеміз. Алдымен белоктар бірінші 
бағытпен жүреді, зарядына қарай оларды изоэлектрлік шоғырландыру 
жолымен изоэлектрлік нүктесіне бағыттайды. Ал екінші бағыты 
ПААГ-тағы электрофорез көмегімен молекулалық салмағын есептейді. 
Екі əдіс те полиакриламид гелінде жүреді. 2Д электрофорезді 
қолданғанда электрофореграмма алынады, мұнда белоктардың көп 
дақтары көрсетілген (2.9-сурет).
Белоктардың біріншілік сəйкестендіру техникасының əдісі полиа-
криламид гелінде (ПААГ) екіншілік гель-электрофорезде жүргізіледі. 
Белоктардың негізін 2Д ЭФ əдісімен зерттейді. Үлгілерді талдауға дай-
ындайды.
2.9-сурет. Адам миы шектерінде пролиферирленген белоктардың 
екіншілік электрофореграммасының түзілуі. Сəйкестендірілген 
белоктардың бөлiкшелер дақтар сияқты нөмірленген 
(http://ru.wikipedia.org/wiki)
2Д ЭФ жүргізгенде сəттілік көбіне зерттелетін нұсқалардың жақсы 
дайындалғанына байланысты. 2Д ЭФ жүргізу барысында нұсқадағы 
белок экстракциясын ең үлкен түрге жетуі жəне ерітінді күйінде ұстау 
қажет. Үлгілерде дайындауда организмнің биологиялық сұйықтығын 
немесе клетка лизатын қолданған қиындық туғызбайды, негізінен, 
бұл құралдарда белоктар ерітінді түрінде кездеседі. Клеткалар тал-
дау кезінде сахарозалы трис-буферде шайылады (10 мМ Трис-HCl, 250 

100
мМ сахароза, рН 7,0). Сосын əртүрлі əдістермен бұзылады. Клетканы 
бұзудың ең оңай əдісі – стандартты лизирленген ерітінділерді қолдану. 
Кей жағдайда мұздатқыш-еріткіш процедурасын, ултрадыбыспен 
өңдеуді немесе френч-прессаны қолданады. Қалың қабырғалы ұлпалар 
мен клеткаларды төменгі температурада құмның көмегімен егейді. 
Полисахаридті қабырғадан тұратын өсімдік клеткаларын сұйық азотта 
қатыру арқылы бұзады жəне қосымша ультрадыбысты қолдану арқылы 
клетка қабырғасы егеледі. Ұлпалар мен клеткалардың бұзу үшін ар-
найы қондырғылар бар.
Клетканы бұзғаннан кейін барлық белоктар немесе олардың көпші-
лігі лизирленген ерітіндінің əсерінен солюбилизацияға ұшырайды. 
Оның құрамында көп мөлшерде зəр қышқылы, бір немесе бірнеше де-
тергент бар, протеаздың тотықтырғышы жəне ингибиторы кездеседі. 
Солюбилизация тиімділігін күшейту үшін бірнеше туыстас хаотроф, 
мысалы, зəр қышқылы жəне тиомочевина қолданылады.
Детергент ретінде CHAPS(3{(3-холомидопропил)диметиламион}-
1-профансульфадты қышқыл), NP-40 (нонидэт Р-40), Х-100 тритон 
қолданылады. 
Балама дитиотрейтол/дитиоэритрол (ДТТ/ДТЕ) фосфин, жеке-
ше трибутилфосфин болады. Қалыптастыратын агенттердің концен-
трациясын төмендету үшін фосфиндерді қолданады. Белоктардың 
қажет емес тотықсыздануы тотықтыратын агенттердің қатысуымен 
толықтырылады. Тотықтырғыштар белоктардың дисульфидтік байла-
ныстарын үзеді. Солюбилизация ерітінді ингибиторларының протеаз-
дары белок детергенттерінің құрамына қажет. Гельде қосымша дақтар 
түзіледі. Негізгі дақтарда белок мөлшері азаяды.
Солюбилизация үшін суда еритін белоктар біріншілік бағыт 
изоэлектлік фокустеу əдісімен бөлінеді. Əдетте, реактивтің стандарт-
ты құралдары қолданылады: 8 М зəр қышқылы, 4% CHAPS, 0,1-0,2% 
амфолиналар, 3-10 жəне 10-100 мМ дитиотрейтол (ДТТ) немесе дитио-
эритрол (ДТЕ) қалыптастырушы ретінде қолданады.
Белок модификациясының қажетсіз тотыққан түрлерін тотықсыз-
дандырғыш агенттерді қосу арқылы қанықтырады. Солюбилиза-
цияланатын химиялық агенттер денатурацияға ұшырап, глобула-
лы белоктарға айналады. Əрбір белокқа тəн амин қышқылының 
қалдықтарын сақтайды. Хаотроптық агенттер – зəр қышқылы мен 
тиомочевина белоктардағы сутектік жəне гидрофобтық байланыстар-

101
ды үзеді. Детергенттер CHAPS, Х-100 тритон жəне сульфобетон SB3-10 
немесе амидосульфобетон ASB-14 белоктардағы гидрофобтық байла-
ныстарды бұзады.
Көптеген белгілі протеомдық карталарда суда еритін карталар 
жөнінде мəліметтер бар. Олар стандартты реактив жиынтық қолдану 
арқылы жақсы солюбилиздендейді. CHAPS, NP-40, Х-100-ді три-
тон детергенттерін зəр қышқылымен комбинациясын қолданғанда 
мембрана белоктарының жақсы солюбилизациясына жеткілікті 
(интегралдықтан басқа) ерітінділерде қолданылатын денатурант-
тар, зарядты ұстамайтын детергенттер, сондықтан олар белоктардың 
изоэлектрлік нүктесімен араластырмайды. Солюбилизация процедура-
лары бiр iзге салғаны белоктардың құрылымдық күйлерін, агрегаттың 
жəне олигомерлі пептидтің белок арасындағы байланыстарын үзеді.
Зерттелетін үлгілердегі белоктарды ең үлкен түрде шығару 
мақсатында əртүрлі буферлер мен детергенттерді қолданады. Бұл үшін 
белоктар ерітінділерде экстракцияланады жəне əр уақытта 2Д ЭФ 
көмегімен бөледі. Ерімей қалғандары процедурадан кейін белоктардың 
алғашқы экстракциясында ерітінділер жаңа экстракциялаушы 
қасиетіне ұшырайды.
Белоктар алдымен буфердің сулы ерітіндісімен экстракциялана-
ды. Сосын қоспа қолданылады. Келесі деңгейде мынадай қоспа: зəр 
қышқылы, тиомочевина /CHAPS, /ASB-14 (амидосульфобетаин), трибу-
тилфосфин қолданылады.
Алайда осындай əдістемені қолданғанның өзінде белок экстрак-
циясының толық шығымын бере алмайды. Бұл өте қатты гидрофобты 
трансмембраналық белоктарға тиісті.
Көп мөлшердегі белоктардың 2Д электрофорез əдісінен туындай-
тын мəселелерін қосымша тазалау əдісін – белок хроматографиясын 
жүргізу арқылы шешуге болады. Мысалы, белоктың бастапқы төмен 
мөлшері аффиндік хроматографияны қолдану жолы арқылы клетканың 
алғашқы лизатында үлкеюі мүмкін. Бұл, негізінен, зерттелетін 
белоктарға тəн арнайы антиденелердің көмегімен жүреді. Хроматогра-
фия əдісінің басқа да түрлерін қолдануға болады.
Белок экстраттары талдау жүргізуге кедергі келтіретін қоспалар –
нуклеин қышқылдары фосфолипидтер, полисахаридтер иондық тұздар, 
қатты бөлшектер. Олар талдау жүргізуге кедергі болады жəне қажетсіз 
белок модификациясына ұшыратады.

102
Мысалы, нуклеин қышқылдары белоктармен байланысып, зерт-
телетін ерітінділердің тығыздығын күшейтеді. Зерттелетін нысандар-
дан қажетсіз заттарды жою қажет. Нуклеин қышқылдары РНҚ жəне 
ДНҚ нуклеазаларымен өңдеу арқылы жойылады. Экстракцияланған 
қоспаға оны енгізу арқылы іске асады. Липидтер преципитация 
арқылы, түздар диализ немесе гель-фильтрлеу арқылы жойылады. 
Қатты заттар центрифугирленеді.
Бір-біріне тəуелсіз полипептидті тізбектің құрамы физикалық-
химиялық екі бөлiкше арқылы жүргізіледі. 
Бірінші деңгейінде 2Д белок электрофорезі, зəр қышқылы немесе 
детергенттер (Х-100 тритон, Р-40 нонидэт) пайдаланылады. Бұл про-
цедура рН градиентінде жүргізіледі, белоктар изоэлектрлік фокустену 
нəтижесінде рН градиентінде электрофоретикалық түрге бөлінеді. 
ИЭФ техникасын тереңірек қарастырайық. Бізге белгілі белок-
тар карбокси- жəне амино-топтарының қатысымен амфотерлік 
(қышқылдық жəне негіздік) қасиетке ие. Бұл топтар рН ортаға тəуелді 
бола тұрып протонданады немесе протонсызданады. Қышқылды орта-
да негіздік амин топтар оң зарядталады. Негіздік ортада қышқылды 
карбоксил топтары теріс зарядталады.
Макромолекула белоктарының қорытынды зарядтары амин 
қышқылдарының қалдықтарындағы оң жəне теріс зарядтарының 
жиынтықтарына тəуелді. Əрбір жеке белок өзіне тəн амин 
қышқылдарының қалдықтарынан тұрады. Олар рН ортаның заря-
дына тəуелді. Изоэлектрлік нүкте рН мағынасына қарай белоктарда 
электрлік зарядтар қалыптасады. ИЭФ рН градиентін орнатқанда бе-
локтар изоэлектрлік нүкте рН баламасына қарай ауысады. Белок рН 
аймағына түскенде, оның мағынасы изоэлектрлік нүктеге байланысты 
олардың қозғалысы тоқтайды жəне олар сол аймақта жиналады.
Демек, ИЭФ нəтижесінде белоктардың изоэлектрлік нүктесіне (ИН) 
сəйкес біріншілік бағыттағы бөлінуі жүреді. Белоктар өздерінің ИН 
мағынасына қарай тар жолақта жиналады. Макромолекулалар зарядқа 
ие емес. Белоктың ИН полипептид тізбектегі амин қышқылдары 
қалдықтарымен анықталады, ИЭФ техникасы қоcпадағы белоктарды 
жақсы ажыратады.
Соңғы жылдары ИЭФ-ті амфолиттің орнына ыңғайлы иммобилиз-
денген рН градиентіндегі нарықтық жолақтарда қолданған. Олар келесі 
талаптарға ие: рН градиентінде иммобилизденген жолақтар əртүрлі 

103
модификацияларда серинді өткізеді жəне процедураны өткізгеннен 
кейін регидрацияға қолдануға дайын болады. Иммобилизденген 
жолақтар көп мөлшердегі белоктарды талдауға көмектеседі. Оларда 
полиакриламидті тасымалдағыш құрамында бекітілмеген амфолин-
дер бар. Жолақтарды өндіретін фирмалар рН-тың үлкен ауқымында 
жұмыс жасауға ыңғайлы. ИЭФ-ке жолақтарды қолданар алдын-
да регидрация процедурасымен өңдеу қажет. Регидрацияға арнайы 
ерітінділер қолданылады. Олардың ішінде: зəр қышқылы детергент 
тотықтыратын дитиотрейтол агент, амфолит, глицерин, көкбромфинол 
кіреді. Жолақтардың регидрациясы арнайы құрылғыларда жүргізіледі.
Арнайы қондырғылардың көмегімен бекітілген рН градиентіне іс 
жүзінде гельдер дайындалады. Кейіннен оларды тар жолақтарға кеседі 
жəне оны ИЭФ-ке енгізеді. Бекітілген рН градиенті жоғары қысымның 
əсеріне де тұрақты. Уақытта амфолиттің орнына ИЭФ көп қолданылып 
жүр.
ИЭФ белоктарына қажетті рН градиент түрлі əдістермен алы-
нады. Бірінші əдіс электр өрісіндегі амфолиндер синтетикалық 
қосылыстардың көмегімен түзіледі. Олар амфотерлі қасиетке ие. 
Гельдегі амфолиндер еркін күйде болады, электрлік өрісте рН градиенті 
оларды тұрақсыз жəне уақыт ішінде дреифтенеді. Бұл нақтылықты 
жəне нəтижені шығаруды төмендетеді.
Бұл мəселені бекітілген рН градиентін қолдану жолымен шешу-
ге болады. Мұнда қышқылдық жəне негіздік қасиетті топтар гельде 
ұсталады. Бекітілген (гельде бекіткен) рН градиенті ИЭФ-ті іске асыруға 
көмектеседі. Түзілген реакция жолында акриламид карбоксилді жəне 
амин топтары мономерлі акриламидті полимеризациялайды.
Электрлік токтың ауқымы – шамамен бір жолаққа 50-70 мкА. Қысым 
ИЭФ-тің жүру уақытына тəуелді. Мысалы, 1 кВ 5 сағат жəне 5 кВ 
1сағат форез жүргізіледі. Қысым биіктігі 305 кВ-ға дейін жоғарылауы 
мүмкін. ИЭФ-тің оңтайлы температурасы – 20оС. Белоктарға ИЭФ 
жүргізілетін кең үңгiрлер (камералар) бекітілген рН градиентінің 
жолақтарымен қолданылады. Ол суретте көрсетілген (2.10-сурет).
ИЭФ əдісімен белоктарды бөлу бастапқы бағытында жоғары 
нəтижеге жеткен. Осы əдіспен тек 100 белоктық жолақты алуға бо-
лады. ПААГ пластинкасындағы аниондық натрий додецилсульфат 
детергенттің қатысындағы электрофорез ИЭФ-тің аяқталуындағы бе-
локты жолақтар кейіннен басталатын аймақ ретінде болады. Ол фрак-

104

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: