-ТАРАУ. НУКЛЕИН ҚЫШҚЫЛДАРДЫ ДНҚ (РНҚ)

110
есептеледі. Бұл үшін НҚ бар дəрi-дəрмектер беттік белсенді заттар-
мен өңделеді жəне белоктар фенолмен экстракцияланады. Нуклеин 
қышқылдарын тазалаудың жəне бөлекшелеудың келесі кезеңі ультра-
центрифугалаудан, түрлі хромататография сұйықтығынан жəне гель-
электрофорезден өтеді. Жеке НҚ бөлу үшін, əдетте, соңғы əдістің түрлі 
нұсқалары қолданылады. 
Белгілі кезеңдерде НҚ талдау жүргізіледі, ол арнайы өңдеулерден 
өтеді жəне оның нəтижесінде бұзылыс немесе клеткалық материалдың 
лизисі пайда болады. 
ДНҚ-ны бөлудің түрлі əдістері іске асады. Бірақ та НҚ биохимия-
сында қолданылатын сынақ жүргізу түрлері ортақ. Ол үш құрамдас 
бөліктен тұрады: 
1) бөлудегі ұлпаның жұмсарту;
2) ДНҚ-ның тұтас құрылымын сақтау;
3) қоспадан тазалау, ол ДНҚ-ның преципитациясына əкеледі.
ДНҚ (РНҚ)-ны бөлудің дұрыс əдісін таңдау, əсіресе зерттелетін 
материалдың сипаттамасымен анықталады. 
Өсімдік клетканың мембранасы мен клетка қабатын бұзу үшін жəне 
ДНК-ны шығарып алу үшін, SDS-Na жəне ЭДТА детергентті буферлі 
қоспаға қосу қажет, сонда клетка ядросының ДНҚ-сы босап шығады. 
ЭДТА ДНҚ-ны эндогенді нуклеазалардың əсерінен сақтайды. Матери-
алды сұйық азотты қолданып езеді. 
Белоктардан жəне полисахаридтерден ДНК-ны бөлу буферлі қоспаға 
аммоний ацетаты, цетил-триметил аммоний бромид (СТАВ), NаС1 
ерітіндісіне жəне хлороформ экстракциясына қосу арқылы іске асады.
Хроматография немесе полимерлердегі екі фаза арасындағы 
ертінділерді, яғни белоктарды жəне полисахаридтерді ультрафильтра-
циямен де жоюға болады. ДНК- мен РНК-ны полисахаридтер мен жеке 
белоктардан тұнбаға түсіру арқылы алуға болады. 
Төменгі молекулалы қоспадан тазалау жəне концентрациялау. 
Тұнбаға түсіру арқылы ДНҚ- мен РНҚ-ны төменгі молекулалы қоспадан 
тазалауға жəне концентрациялауға болады (3.1-кесте). Бұл үдерісті ди-
фильтрлеу арқылы да жүзеге асыруға болады. Егер жмДНҚ-ны бөліп 
алу қажет болмаса, онда тангенциальды ағысты плоскорамды жіңішке 
арналы қондырғылы немесе волокномен толтырылған қондырғылы 
ультрафильтрацияны қолданған тиімдірек. Сонымен қатар ДНҚ-мен 
РНҚ-ны төменгі молекулалы қоспадан тазалау жəне концентрациялау 
үшін сұйық хроматографияны қолдануға да болады.

111
3.1-кесте 
Нуклеин қышқылын тазалауда түрлі реагенттерді қолдану
Тұнбаға түсіретін 
реагент
Тұнбаға түсіру жағдайы
Тұнбаға түсетін биополимер-
лер (ДНҚ, РНҚ, белоктар, 
полисахаридтер)
Аты/ 
формула
Со
ң
ғы
ко
нц
ет
ра
ци
яс
ы
, %
Ерітінді 
құрамы
Инку
ба
ци
я 
уа
қыты
жəне
те
мп
ер
ат
ур
ас
ы
ДНҚ
Вм
РН
Қ
Нм
РН
Қ
Бел
ок
тар
По
ли
са
ха
ри
дт
ер
Реагент
Со
ң
ғы
ко
н
це
н
тр
ац
и
я
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Этанол
67
Na 
ацетаты 
0.1М
0,5 час., 
20°С
+
+
±
±
±
Этанол
67
Na 
ацетаты
0.83М
0,5 сағ., 
70°С
+
+
±
±
±
Этанол
71
Na 
ацетаты
0.1М
0,5 сағ., 
20°С
+
+
+
±
±
Изопропанол
50
Na 
ацетаты
0.1М
0,5 сағ., 
20°С
+
±
-
±
±
Изопропанол
35
Na 
ацетаты
0.1М
30 мин., 
20°С
+
+
+
±
-
СТАБ
0,5-1
NaCl 0.4М
0,5 сағ., 
20°С
+
+
+
±
-
Спермин
0,1-10 
мМ*
15 мин., 
0°С
+
+
±
-
-
ПЭГ-6000
8-10
NaCl
0,8-
1М 
30 мин., 
0°С
+
+
+
±
±
LiCl
2М 1-2 
с, 0°С
-
+
-
-
-
Мағынасы: жмРНҚ – жоғары молекулярлы РНҚ (28s, 26s, 18s, 16s 
рРНҚ жəне мРНҚ); тмРНҚ – төменгі молекулярлы РНҚ (тРНҚ, 5s и 
5,8s рРНҚ; деградация өнімі жмРНҚ); + – сандық тұнбаға түсу; ± – 
бөлшектік тұнбаға түсу; - – тұнба жоқ; ПЭГ-6000 – полиэтиленгли-
коль орташа молекулярлық массасымен 6000; * – ерітіндідегі тұз кон-
центрациясына тəуелді.

112
Нуклеин қышқылын фракциялау. РНҚ-дағы ДНҚ-ның қоспасын 
РНҚ-азадан еркін ДНҚ-азаның бірімен бөлуге болады. ДНҚ-дағы РНҚ-
ның қоспасын ДНҚ-азадан еркін РНҚ-азаның бірімен бөлуге болады. 
ДНҚ мен РНҚ-ны қатаң түрде фракционирлеу, төменгі жəне жоғарғы 
молекулалардың қоспасынан тазалау, тұссыздандыру мен концентра-
циялау келесі əдістермен жүргізіледі – тұнбаға түсу (3.1-кесте);
– ультрафильтрация; 
– полимерлердің сулы ерiтінділер арасымен орналасуы; 
– сұйық хроматографиялардың бағанадағы көлемі. 
ДНҚ-мен РНҚ-ның жіңішке бөлекшелеуі төменгі, орташа немесе 
жоғарғы қысымды бағаналы сұйық хроматографияда жүргізіледі.
Еріткішті жою. Судағы ДНҚ- мен РНҚ-ның ерітінділерін лиофи-
лизирлеуге болады. ДНҚ мен РНҚ ерітінділерін тұнбаға түсіруге, 70% 
этанолға натрийдің шайылып тұнбаға түсірген тұзын апаруға болады, 
құрамы рН 5-6 0,1-0,3 М натрий ацетаты, тұзды 70% этанолмен шаяды, 
сосын судан 96 % этанолмен жəне вакуумде немесе ауада кептіреді. 
ДНҚ-ның кептірілген тұнбасын 0,1 мл ТР ерітеді (0,05 М трис-НС
рН 8, 0,1 мМ ЭДТА), шамамен 30 мин салқында ұстайды.
Клеткалық фрагменттерді жою үшін центрифугирлейді. ДНК су-
пернатантын талдау үшін қолданады немесе -20°С-та сақтайды.

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: