Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
Трансформацияланған темекі өсімдігінің (Nicotiana tabacum
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
Kenzhebayeva (1) (1) (1)
| 4.9. Трансформацияланған темекі өсімдігінің (Nicotiana tabacum
L.) трансгенді табиғатын ПТР-талдау əдісі бойынша тексеру Жалпы мағлұматтар. Өсімдіктердің трансформациясы үшін вектордың құрамына функционалдық геннен басқа селективті мар- керлер де кіреді. Трансформация үшін векторлық конструкциялар- да көбінесе канамицин (npt II гені) жəне гигромицин (hpt II гені) антибиотиктеріне төзімділікті кодтайтын гендер немесе фосфинотри- цин (BASTA) (bar гені) гербицидке қолданылады. Трансгенді өсімдіктердің 1-лік селекциясына сəйкес антибиотиктері бар орталарда жүргізеді. Осындай ортада геномында селективті 177 маркерлері бар өсімдіктер регенерацияланады. Дегенмен селективті маркері бар ортада өсуге қабілетті өсімдіктердің барлығы нағыз трансгенді бола бермейді. Антибиотиктердің концентрациясына жəне ұлпаның түріне тəуелді трансформацияланбаған өркендер селекция үдерісінде өсе алады. Сол себепті селективті ортада өсімдіктердің өсуі абсолютті түрде трансгенді табиғаттың дəлелі бола алмайды. Өсімдік геномында Т-ДНҚ тізбегінің болуының дəлелі үшін полимеразалық тізбектік реакция (ПТР) көмегімен талдау жүргізеді жəне радиоактивті шолғы ретінде Т-ДНҚ бөлігін қолданып, трансгенді өсімдіктердің хромосомдық ДНҚ-сының блот-гибридизация əдісімен талдау жүргізу өте қиын, дегенмен алынған нəтижелерден трансформацияның жүрген жəне жүрмегенін біліп қана қоймай, сонымен қатар өсімдік геномында Т-ДНҚ көшірмелерінің енгізілген санын анықтауға мүмкіндік береді. ПЦР-талдау бұған қарағанда сəл оңайырақ. Оның көмегімен өсімдік геномында векторлық конструкцияның Т-ДНҚ-фрагменттерінің болу- ын дəлелдеуге болады. ПТР-талдау таңдап алынған, праймермен шектелген ДНҚ бөлігінің көбейтілуіне (көпреттік репликациясына) негізделген. Комплемен- тарлы тізбегі бар құрамы белгілі (15…30 ж.н.) бір тізбекті олигону- клеотидтер праймер болып табылады. Регенерлеуші өркендердің трансгенді табиғатын анықтау үшін көбінесе канамицин антибиотигіне төзімділікті кодтайтын npt II геніне гомологиялық тізбекті праймерлер қолданылады. Жұмысты орындау реті. Жаппай ДНҚ-ны бөліп алу үшін трансформацияланған өсімдік жапырағының фрагментін (0,5 см 2 ) алады. Алынған ДНҚ-ның концентрациясын анықтайды. ПТР-анализ жүргізу үшін микротүтікке келесі құрамдас бөлiктерді: ПТР үшін 2 мкл-ден 10-реттік буферді, 2 мМ dNTP, 25мМ MgCl 2 жəне 1 мкл-ден əрбір праймерді қосады. Содан кейін 50 нг ДНҚ жəне 20 мкл көлемге дейін иондалған су қосады. Стерильді жағдайды қадағалай отырып, су моншасында реакциялық қоспаны жинайды. Трансформацияланған өсімдік – регенеранттарынан бөлініп алынған талданатын ДНҚ-мен реакциялар жүргізуден басқа, бір уақытта бақылау реакцияларын да жүргізеді. Трансформацияға оң бақылау ретінде темекі өсімдігінің трансформациясы үшін қолданылған плазмидалық вектордың ДНҚ- сын алады (10 мМ концентрациясында). Трансформацияға теріс бақылау ретінде экстрагирленген трансформацияланбаған өсімдіктерден ДНҚ алады. Мүмкін болатын ПТР ластануларының бақылауы ретінде бір 178 түтікке ДНҚ қоспайды. Түтікте қоспаны араластырады жəне ми- кроцентрифугада 12000 айналымда (g) 1-3 с аралығында тұнбаға түсіреді. Түтiктерді термоциклерге қояды. Үлгілердің негізгі дена- турациясын 95ºС температурада 5 мин аралығында жүргізеді: 30 с 94 ºС-та, 30 с 65ºС-де, 45 с 72 ºС-де. Көбейту аяқталғаннан кейін реакциялық қоспаға 2 мкл буферді агарозалық гельге енгізу үшін қосады. Нəтижелерді 1%-тік агароздық гель-электрофорезі əдісімен талдайды. Тек трансгенді өсімдіктердің ДНҚ талдау жағдайында ғана бөлік көбейтіледі, плазмидалық вектордың бақылау ДНҚ-сы бар түтікшенің ДНҚ-бөлігінің мөлшеріне тең фрагмент амплификацияла- нады. Трансформацияланбаған өсімдіктер жағдайында көбейту бол- майды. Алынған нəтижелер бойынша жүргізілген трансформацияның тиімділігін анықтайды. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|