В данном обзоре рассмотрены основные методы создания гетерологических биохимических путей в различных организмах, основные проблемы, воз- никающие при этом, и основные подходы к их ре- шению
жүктеу/скачать 0,69 Mb. Pdf көрінісі
|
Лекция №6.1
| Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris (Komagataella), Candida boidinii , Hansenula polymorpha , Pichia methanolica, Yarrowia lipolytica Мицелиальные грибы Неприхотливые быстрорастущие культуры Большое разнообразие нативных вторичных метаболитов, облегчающее выбор подходящих предшественников Избыток нативных метаболических путей – выработка желаемого продукта вынуждена конкурировать с метаболизмом хозяина Споры, опасные для здоровья Ограниченные уровни экспрессии Aspergillus spp., Neurospora crassa Растения Особенно пригодны для гетерологической экспрессии метаболических путей других растений Эффективная продукция крупных ферментов Хозяин может быть представлен целым организмом или клеточной культурой Возможность локализации гетерологического метаболического пути в хлоропласте Высокая стоимость манипуляций и культивирования Сложные протоколы трансформации Низкие скорости роста и размножения Nicotiana benthamiana, N. tabacum, Arabidopsis thaliana, Physcomitrella patens, Chlamydomonas reinhardtii Культуры клеток животных Высокоэффективные методы вирусной трансдукции Эффективное производство ферментов животного происхождения (в том числе специфические модификации белков) Отсутствие клеточной стенки – удобство в очистке продукта Высокая стоимость культивирования Требуют сложного оборудования и специфических условий культивирования Низкая скорость роста Клетки млекопитающих, клетки насекомых ОБЗОРЫ ТОМ 12 № 2 (45) 2020 | ACTA NATURAE | 31 не вырабатывают никаких известных онкогенных или токсичных веществ [23–25]. В частности, удобным гетерологическим хозяином является S. cerevisiae, поскольку разработана об- ширная методология контроля экспрессии гетероло- гических биосинтетических метаболических путей в этом организме. Общие методы гетерологической экспрессии метаболических путей в дрожжах, а так- же успешные примеры гетерологического биосинтеза вторичных метаболитов в S. cerevisiae см. в обзоре [6]. Описана обширная библиотека конститутивных и индуцибельных промоторов с различной силой экспрессии в P. pastoris (например, индуцируемый метанолом промотор гена алкогольоксидазы I (P AOX1 ), активируемый добавлением метанола и инактиви- руемый добавлением глюкозы, глицерина или эта- нола) [26]. Если требуется несколько промоторов, то избежать спонтанной рекомбинации in vivo можно с помощью различных индуцибельных промоторов. Для метаболической инженерии полезны также сек- венированные и аннотированные геномы нескольких штаммов P. pastoris [27]. Кроме того, для облегчения создания векторов, совместимых с P. pastoris, раз- работано несколько специализированных наборов клонирования [28, 29]. В качестве гетерологических хозяев могут исполь- зоваться также другие типы дрожжей, например, метилотрофные дрожжи Candida boidinii, Hansenula polymorpha и P. methanolica [30] и жировые дрожжи Yarrowia lipolytica, способные метаболизировать сы- рую нефть [31, 32]. Среди различных мицелиальных грибов в каче- стве гетерологических хозяев наиболее часто исполь- зуются Aspergilli [19]. К несомненным преимуще- ствам грибов относятся простота культивирования и быстрый рост биомассы [33]. Для гетерологической экспрессии кластеров генов из других мицелиаль- ных грибов чрезвычайно удобными в качестве хозяев могут быть виды Aspergillus spp., поскольку в этом случае можно использовать исходные промоторы и терминаторы. Например, кластер генов биосинтеза пенициллина был успешно перенесен в Neurospora crassa и A. niger [34]. Однако в некоторых случаях для увеличения выработки метаболитов все же необ- ходимо заменить исходную регуляторную последова- тельность промотором организма-хозяина, посколь- ку экзогенные последовательности, как правило, относительно слабы и/или могут экспрессироваться только в определенных условиях [22, 35]. Общую ин- формацию о стратегиях гетерологической экспрес- сии метаболических путей в Aspergilli см. в [36]. Перспективной системой экспрессии гетерологи- ческой продукции растительных природных соеди- нений являются растения [37]. Многие биосинтети- ческие пути растений требуют посттрансляционных модификаций, коферментов, кофакторов, регуля- торов и расположены в специфических органеллах [38]. Поэтому, если целевой метаболический путь включает большие и плохо совместимые с други- ми системами ферменты, то в высшей степени обо- сновано использование метаболической инженерии растений. При работе с растениями важно понимать, что их метаболизм значительно варьирует в зависимости от вида, ткани и стадии развития, и часто во время цветения растение меняет свой метаболический про- филь почти до неузнаваемости [39]. Методы инжене- рии метаболизма растений рассмотрены в [40]. Следует отметить, что растения могут быть ис- пользованы в качестве системы экспрессии как в форме целого организма, так и в виде клеточной культуры. Каждый вариант имеет свои преимуще- ства: целый организм самодостаточен и требует ми- нимального обслуживания со стороны исследователя, а культура клеток обычно дает большее количество целевого метаболита [38]. В настоящее время в каче- стве источника клеточных культур особенно привле- кательны более примитивные растения – мхи и водо- росли [41]. Компартментами биосинтеза различных метабо- литов служат хлоропласты – полуавтономные ор- ганеллы растительных клеток. Благодаря двойной мембране и высокой концентрации АТР, а также ввиду содержания в них различных низкомолеку- лярных соединений эти органеллы также явля- ются многообещающей мишенью биоинженерии. Показано, что локализация гетерологического пути в хлоропластах обычно приводит к значительному увеличению продукции целевого метаболита [42, 43]. К недостаткам растений как гетерологических хозяев относятся: сравнительно высокая стоимость разработки, сложные протоколы трансформации, медленный рост и скорость размножения, а также негативное отношение общественности к генетически модифицированным растениям. жүктеу/скачать 0,69 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|