Репликация днк: учебное пособие
жүктеу/скачать 2,57 Mb. Pdf көрінісі
|
|
4.3.1.4. Реакция праймирования Инициация репликации и прерывистый синтез ДНК на отстающей цепи происходит по РНК-праймерному механизму и является универсальным свойством репликации ДНК у про– и эукариот. ДНК-праймаза отличается от других РНК-полимераз целым рядом присущих только ей свойств. Во-первых, матричной и субстратной специфичностью. Во-вторых, необычной процессивностью – синтезом мультимеров, кратных 10-нуклеотидным звеньям. В-третьих, низкой точностью и устойчивостью к некоторым ингибиторам РНК– и ДНК-полимераз. Здесь необходимо вернуться к проблеме синтеза РНК-праймеров. Синтез РНК-праймеров на природных матрицах начинается во множественных, но не случайных участках, его ини- циация происходит с АТР или GТР даже при высоких концентрациях СТР и UTР. Пока- зано, что, например, ДНК вируса SV40 содержат предпочтительные участки инициации – 3'- dСТТТ или 3'-dССС, расположенные внутри участков из 7-25 пиримидиновых нуклеотидов. Высокое соотношение АТР/GТР повышает вероятность инициации в участках 3'-dСТТТ, а низкое – в участках 3'-dССС. Таким образом, концентрация NТР и нуклеотидная последо- вательность матрицы определяют участки инициации. Впрочем, участки инициации in vivo заметно отличаются от участков инициации, используемых во время репликации ДНК SV40. Во многих случаях обнаружена последовательность 5'-YYYYYYYYСТТТYYYY-3', где Y = С или Т, которая является стартовой площадкой для инициации синтеза ДНК-праймазой в составе комплекса с ДНК-полимеразой α. Минимальная длина пиримидинового кластера должна быть не менее 7 н. Замена одного из пиримидинов на 3'-конце кластера значительно понижает частоту инициации, а замены внутри и вне кластера приводят к смещению точки старта. Известно, что матрицу распознает сама ДНК-праймаза. Стартовый нуклеотид вновь синтезированного праймера всегда является пурином (чаще всего – аденином). Этот комплекс имеет еще одну специфическую функцию – синтез теломерной отста- ющей цепи ДНК млекопитающих осуществляет ДНК-полимераза α-праймаза. И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие» 38 ДНК-праймаза – сравнительно медленный фермент. Средняя скорость включения NTP этим ферментом примерно на два порядка меньше, чем скорость включения dNТР ДНК- полимеразой α. ДНК-полимераза α способна удлинять праймеры длиной более 7-10 н. Про- дукты длиной 2–6 н. не являются субстратами ДНК-полимеразы α и называются абор- тивными, До синтеза РНК-праймера ДНК-полимераза α и ДНК-праймаза действуют неза- висимо, а после этого их активности координируются. Синтезированный РНК-праймер перемещается в полимеразный активный центр без диссоциации в раствор. Это внутримо- лекулярное перемещение праймера в дуплексе с матрицей является быстрым и сравнимо по скорости с синтезом праймера. После того как ДНК-полимераза α удлинит праймер, прай- маза начинает синтез нового праймера, и цикл повторяется. ДНК-праймаза эукариот отлича- ется от других РНК-полимераз своей способностью к включению дезоксирибонуклеотида в праймер, таким же свойством обладает и праймаза прокариот. Одним из возможных объясне- ний необходимости включения dNТР в 3'-конец праймера является необходимость перехода от А-формы к В-форме ДНК. Поэтому понимание механизма "переключения" комплекса ДНК-полимеразы α-праймазы от синтеза РНК к ДНК имеет очень большое значение. Спо- собность праймазы узнавать одновременно и рибо-, и дезоксириботрифосфаты представляет серьезный научный интерес. Выбор РНК-праймера определяется гидрофобным характером белково-нуклеиновых взаимодействий. В случае гибрида РНК-ДНК дуплекс находится в А-форме, в которой обес- печивается оптимальный баланс между гидрофобными и комплементарными взаимодей- ствиями оснований матрицы и праймера. После инициации рост праймера сопровождается извлечением оснований матрицы из гидрофобной полости белка для спаривания с основаниями растущей цепи РНК. В условиях такой конкуренции короткие ди– и тринуклеотиды легко диссоциируют, образуя абортивные продукты. С ростом длины праймера прочность дуплекса увеличивается, ослабевает влия- ние гидрофобности активного центра, и пары оснований приближаются к оси спирали. При длине праймера 7 н создаются условия для включения дезоксинуклеотида и перехода в энер- гетически более выгодную В-форму. Здесь нужно учитывать и большее сродство к ферменту dNТР по сравнению с NТР. Предложенная концепция, по-видимому, носит универсальный характер, поскольку подобное происходит и при инициации транскрипции. ДНК-полимераза α связывает сначала матрицу, затем праймер и субстрат. ДНК-поли- мераза α наиболее активна на двунитевой ДНК, содержащей бреши длиной не менее 20–30 н. Область связывания матрицы с ДНК-полимеразой α является достаточно протяженной. Она строго защищает от гидролиза 9 н праймерной цепи, 13 н двухцепочечного участка и 14 н одноцепочечной матрицы и слабо защищает несколько оснований вне этого района. Фер- мент связывается с 19–20 н матрицы посредством ионных и гидрофобных взаимодействий, эффективность связывания при этом коррелирует с гидрофобностью оснований матрицы. Отличительной особенностью ДНК-полимеразы α является ее способность удлинять РНК-праймеры и прочная ассоциация с ДНК-праймазой, которая синтезирует эти праймеры. Средняя процессивность ДНК-полимеразы α составляет 20–50 н. Праймаза редко оши- бается в момент синтеза динуклеотида, но затем легко использует неправильные NТР. Хотя скорость включения ошибочных нуклеотидов зависит от нуклеотидной последовательности матрицы и самого неправильного нуклеотида, в принципе, ДНК-праймаза является самым неточным нуклеотид-полимеризующим ферментом. В некоторых случаях один неправиль- ный нуклеотид приходится менее чем на 100 правильных. Встраивание неправильного нук- леотида не препятствует включению следующего правильного нуклеотида. Праймаза может полимеризовать сходные нуклеотиды и генерировать праймеры с множественными ошиб- ками, котрые не ингибируют дальнейший синтез и после внутримолекулярного переноса в ДНК-полимеразный активный центр удлиняются ДНК-полимеразой в присутствии dNTP. И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие» 39 Существуют две модели механизма синтеза праймеров, некомплементарных матрице. Согласно первой модели, фермент просто включает некомплементарные матрице нуклео- тиды. Вторая модель предполагает включение нуклеотида, комплементарного матрице, с последующим скольжением праймера относительно матрицы. Низкая точность ДНК-прай- мазы послужила основой гипотезы о том, почему именно РНК является затравкой при репли- кации ДНК. Поскольку первые нуклеотиды могут ошибочно включаться в новую растущую цепь, предполагается, что РНК-праймер отмечает "высокоошибочный" участок для после- дующего вырезания и более точной застройки. Эта точка зрения выглядит убедительной, но, вероятно, главная причина появления РНК-праймера связана все-таки с более эффективной инициацией синтеза ДНК при наличии А-формы РНК-ДНК дуплекса. В отличие от праймазы ДНК-полимераза α является достаточно точным ферментом. Она делает в среднем от 1/30 000 до 1/50 000 ошибок. Важную роль в обеспечении спе- цифичности синтеза играют белковые факторы репликации. В присутствии RРА точность ДНК-полимеразы α повышается. Известно, что различие свободных энергий образования правильных и неправильных пар оснований в активном центре полимеразы, по-видимому, в 10 раз больше, чем в водной среде. Выделенные из клеток высокомолекулярные формы ДНК-полимеразы α могут обла- дать другими активностями помимо ДНК-полимеразной и праймазной. Эти комплексы пред- ставляют собой фрагменты репликативной машины клеток. В комплексе, осуществляющем репликацию лидирующей нити, ДНК-полимераза α связана с ДНК-полимеразой δ, а в ком- плексе, синтезирующем запаздывающую цепь, – с ДНК-полимеразой ε. У эукариот оба ком- плекса связаны, вероятно, друг с другом в репликативной вилке подобно тому, как связаны холоферменты синтеза лидирующей и запаздывающей нити у прокариот. Об этом свидетель- ствует выделение из клеток человека комплексов, названных синтесомами и содержащих ДНК-полимеразы α, δ и ε, а также ряд других репликативных белков, среди которых ДНК- праймаза, репликативный фактор RFC, РСNА, поли(АDР-рибозо) – полимераза и ДНК- лигаза I. Из этого высокомолекулярного комплекса недавно выделены и охарактеризованы ДНК-геликаза А с молекулярной массой 90 кДа и 5' → 3'-экзонуклеаза с мол. массой 47 кДа. С ДНК-полимеразой α может быть также связан белок Р1 из клеток мыши, являющийся гомологом белка МсмЗ дрожжей. Комплекс ДНК-полимераза α-праймаза в ходе мейоза дис- социирует. Большой Т-антиген SV40 (и других паповавирусов) взаимодействует с субъединицами р180 и р70 в комплексе ДНК-полимераза α-праймаза и рекрутирует этот комплекс в ori вируса. При репликации вируса папилломы ДНК-полимераза α связана с вирусной гелика- зой Е1. Негативная регуляция комплекса в клеточном цикле зависит не только от фосфори- лирования р180, но также от фосфорилирования субъединицы р68 циклинА-зависимыми киназами. В клетках дрожжей комплекс ДНК-полимераза α-праймаза связан с хроматином в фазах G1 и S клеточного цикла, но не G2/М. Связывание с хроматином зависит от дефос- форилирования субъединицы 86 кДа (гомолог р70) в конце митоза. жүктеу/скачать 2,57 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|