Решением Учебно-методического совета фгбоу дпо рманпо минздрава России «28» ноября 2016г
Методы клинических лабораторных исследований
жүктеу/скачать 4,09 Mb. Pdf көрінісі
|
| 2.6. Методы клинических лабораторных исследований
Фотометрические методы анализа. Фотометрический анализ – один из самых распространенных методов, он характеризуется высокой чувствительностью и возможностью определения большого количества веществ. При фотометрическом анализе используется способность химических соединений поглощать лучистую энергию определенных длин волн. Открытие новых реагентов, образующих окрашенные соединения с веществами, разработка принципов сопряженных реакций, оснащение лабораторий биохимическими анализаторами делает применение этого 106 метода одним из самых распространенных в КДЛ. Инструментальные методы позволяют использовать спектры поглощения, лежащие как в ультрафиолетовой, так и в инфракрасной областях спектра. Фотометрические исследования проводятся на фотометрах и спектрофотометрах. Фотометры – оптические приборы, позволяющие измерять световой поток на фиксированных длинах волн. Сплошные спектры изучаются с помощью спектрофотометров. Абсорбционная фотометрия. Определение концентрации окрашенного вещества в растворе оптическими методами основывается на законе Бугера-Лаберта-Бера, который формулирует выражение для оптической плотности: D = С·l ,где D – оптическая плотность раствора или абсорбция, С – концентрация поглощающего вещества, l – толщина кюветы, через который проходит свет, – молярный показатель поглощения (экстинкции), зависящий от длины волны и природы вещества. Молярный показатель поглощения ε λ является константой данного раствора вещества при данной длине волны оптического излучения. Величина оптической плотности D безразмерна, но может исчисляться в «беллах» (сокращение – Б). Таким образом, закон Бугера-Ламберта-Бера устанавливает, что абсорбция светового потока определенной длины волны ( А ) прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества. В кювете с фиксированной длиной оптического пути (в клинической химии принята стандартная кювета в 1 см) абсорбция и концентрация связаны через коэффициент молярной абсорбции. Для каждого вещества характерен свой спектр поглощения, причем он часто разный для окисленных и восстановленных форм. На изменении спектра поглощения при переходе окисленная восстановленная форма аналитов основано определение концентрации большинства субстратов и активности практически всех ферментов. Исследование аналитов рекомендуется проводить при длине волны облучения, соответствующей 107 максимальному поглощению, то есть длине волны, при которой максимален коэффициент молярной экстинкции . Это связано с тем, что при максимальном максимальна чувствительность фотометрического определения изменений концентрации аналита. Прямая пропорциональность между абсорбцией и концентрацией сохраняется в пределах определенного оптического диапазона, который является характеристикой конкретного оптического прибора. Линейный оптический диапазон прибора устанавливается экспериментально (приводится в технических характеристиках прибора). В современных фотометрах и биохимических анализаторах линейный оптический диапазон составляет от 0,1 до 2,5 и даже 3,0 ед. оптической плотности. Разрешение или чувствительность оптической системы – это та минимальная разница в оптической плотности раствора в кювете в 1 см, которую может различить прибор. Современные фотометры позволяют измерять растворы с разрешением до 0,001 ед. оптической плотности. Чем выше разрешение, тем с большей точностью данная система способна измерять концентрацию (активность) аналитов. Разрешение зависит от абсолютного значения оптической плотности. Вне линейного диапазона оптической плотности (< 0,1 или > 3 ед. оптической плотности) разрешение ухудшается. Ограничения по диапазону оптической плотности накладывают соответствующие ограничения на диапазон измеряемых концентраций аналитов. Результатом этого является то, что абсорбционная фотометрия надежно регистрирует изменения содержания аналитов в пределах 1-2 порядков и не более. Этого достаточно для определения изменений концентраций основных биохимических показателей, таких как общий белок, билирубин, глюкоза и изменений активностей ферментов аминотрансфераз, фосфатаз, дегидрогеназ. В общем виде – это скрининговые показатели «биохимического благополучия» или «биохимической патологии». Однако количественные изменения конкретных метаболитов (гормоны, 108 онкомаркеры, компоненты протеолитических систем), определение которых диагностирует нозологическое заболевание, методами абсорбционной фотометрии определить не удается. Для этой цели применяются иммунохимические методы. жүктеу/скачать 4,09 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|