Особенности микроскопических методов при микробиологических

130 
Варианты метода при учете результатов с помощь люминесцентного 
микроскопа в различных модификациях под разными названиями – реакция 
иммунофлюоресценции (РИФ), прямой иммунофлюоресцентный анализ 
(ПИФ), метод флуоресцентного анализа (МФА) — широко применяются в 
настоящее время. 
Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого 
спектра диагностических наборов и быстротой получения ответа. Чаще всего 
РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом 
материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на 
предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют 
метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда 
входящим 
в 
состав 
диагностического 
набора. 
На 
поверхность 
фиксированного мазка наносят меченные флоуоресцеинизотиоцианатом 
сыворотки или моноклональные антитела.
Выделяют прямую и непрямую иммунофлюоресценцию.
Прямой иммунофлюоресценцией тканевые антигены, инфекционные 
агенты или отложения сывороточных белков в тканях или клетках 
обнаруживаются с помощью меченных флюорохромами антисывороток или 
моноклональных антител. Прямая иммунофлюоресценция используется 
преимущественно для морфологических исследований биопсий ткани, 
цитологических и микробиологических исследований. В диагностике 
аутоиммунных 
заболеваний 
метод 
прямой 
иммунофлюоресценции 
используется для обнаружения отложений иммуноглобулинов и факторов 
комплемента в биопсиях кожи и почек. 
Непрямая иммунофлуоресценция относится к тестам, в которых 
применяются для обнаружения антигенов флуоресцентномеченные антитела. 
Криосрезы ткани, клетки или микроорганизмы используются как «субстрат», 
с которым связываются меченные аутоантитела. В результате с помощью
люминесцентного микроскопа можно описать разные типы свечения. Так 
антинуклеарные антитела могут быть направлены как к антигенам 

131 
нуклеохроматина, который диффузно распределен в ядре, так и к 
компонентам ядрышка. Для того чтобы различить эти варианты выявления 
антинуклеарных антител, наряду с титром антинуклеарного фактора, 
описывается «тип свечения» ядра клетки. Типы свечения могут быть 
описаны при выявлении антинейтрофильных антител, антикератиновых 
антител, антимитохондриальных антител и многих других. Несомненным 
преимуществом непрямой иммунофлуоресценции является возможность 
оценки одновременного связывания аутоантител со всем разнообразием 
антигенов, которое имеется в тканевом субстрате. Это делает 
иммунофлуоресценцию удобной для скринингового использования и 
обуславливает большое значение этого метода в аутоиммунной диагностике. 
Возможно проведение всех стадий иммунофлуоресцентного анализа в 
полностью автоматическом режиме. Встроенная в микроскоп камера делает 
снимки высокого разрешения и автоматически сохраняет их в базе данных. 
Предварительная оценка результатов (положительный или отрицательный) 
происходит автоматически. 
Инвертированные 
микроскопы. 
По 
расположению 
объектива 
относительно препарата и источника света микроскопы бывают прямые и 
инвертированные. Инвертированные микроскопы проходящего света 
представляют собой «перевернутую» конструкцию обычного микроскопа : 
осветитель проходящего света расположен над объективом и имеет большое 
рабочее расстояние, тем самым беспечивается свободный доступ 
инструмента (манипулятора, иглы, пипетки) к препарату, который находится, 
например, в чашке Петри. При применении фозовоконтрастных устройств, 
конденсоров темного поля и косого освещения возможно наблюдение 
малоконтрастных препаратов. 
Метод темного поля. Используют метод при исследовании 
малоконтрастных объектов, которые невозможно покрасить. Метод основан 
на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света, 
внутренняя 
апертура 
которого 
превосходит 
числовую 
апертуру 

132 
применяемого объектива. Таким способом достигается эффект, что ни один 
прямой луч не попадает в объектив (темное поле). При наличии объекта 
будет наблюдаться яркое блестящее свечение контура вокруг объекта на 
темном фоне в отраженном свете. Метод применяется для наблюдения 
живых леток. Микроорганизмов, прозрачных кристаллов и других элементов, 
когда достаточно наблюдать контур.  
Метод фазового контраста. Метод позволят увидеть элементы 
внутренней структуры прозрачного объекта. Фазово-контрастное устройство 
дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, 
проходящих через объект, в амплитудные. В результате прозрачные объекты 
становятся видимыми.  
Цитохимические исследования. Цитохимические методы представляют 
собой достаточно простые, воспроизводимые, не требующие сложной 
аппаратуры методики. Цитохимические исследования позволяют изучить 
ферментативную активность, содержание различных веществ в клетках 
крови, костного мозга, лимфатических узлов и других тканей, позволяют 
выявлять 
направленность 
дифференцировки 
кроветворных 
клеток. 
Цитохимические реакции выполняют на мазках, на предметных стеклах, 
применяя соответствующую фиксацию и докрашивание клеток. Оценка 
результатов в большинстве случаев ограничивается определение реакции – 
слабая, умеренная, интенсивная.  
Основой идентификации клеток служат особенности метаболизма, 
специфичные для каждого типа клеток. Например, миелопероксидаза , 
являющаяся лизосомальным ферментом, локализуется преимущественно в 
специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и 
является маркером клеток миелоидного ряда. Липиды обнаруживаются 
практически во всех лейкоцитах, за исключением лимфоцитов. Однако 
основная масса липидов связана с клетками гранулоцитарного ряда. 
Определение неспецифической эстеразы используется для идентификации 
лейкозных моноцитарных предшественников. Определение активности 

133 
щелочной фосфатазы применяют для дифференцировки хронического 
миелолейкоза от других миелопролиферативных заболеваний и реактивных 
состояний. Окраска на кислую фосфатазу используется для выделения 
волосато-клеточного 
лейкоза 
из 
группы 
лимфопролиферативных 
заболеваний.

жүктеу/скачать 4,09 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: