Селекция. Понятие. Методы селекции. Практическое значение селекции для биотехнологии
жүктеу/скачать 43,57 Kb.
|
31-60
| Охарактеризуйте понятия "донор" и "донатор". Донор - Биообъект, поставляющий материал для процесса производства лекарственного средства без ущерба для собственной жизнедеятельности Донатор - Биообъект, у которого забор материала для производства лекарственного средства оказывается несовместимым с продолжением жизнедеятельности Цели и методы совершенствования биообъектов. Основная цель биотехнологического процесса - получение в масштабных количествах высокоэффективного конечного продукта, что становится возможным лишь при оптимизации методических подходов, а также в условиях применения биообъектов с совершенными свойствами продуцента или биокатализатора. Изменение биообъекта, направленное на улучшение его характеристик и благоприятное для его использования в производстве, называется совершенствованием. Совершенствование биообъекта — это получение продуцентов с мутациями в геноме, которые отличаются от исходного биообъекта в сторону улучшения биотехнологических свойств, в частности, в сторону увеличения образования целевого продукта. Цели, которые преследуют при совершенствовании продуцента: ► увеличение продуктивности в достижении большего выхода лекарственных веществ на единицу биомассы; ► придание продуценту способности использовать менее дефицитные и более дешевые среды; ► отсутствие возможности развития реакции ретроингибирования при биосинтезе конечного продукта; ► устойчивость продуцента к бактериофагам; ► нетребовательность к оборудованию, то есть биосинтез не должен снижаться при несовременной технологии оборудования; ► оптимизация свойств продуцента в аспекте медицинской промышленности (продуцент не должен иметь неприятного запаха и т.д.). Выделяют несколько направлений совершенствования биообъектов: мутагенез, селекцию, клеточную и генную инженерию. Селекция. Понятие. Методы селекции. Практическое значение селекции для биотехнологии. Селекция — это наука, разрабатывающая методы получения новых и совершенствования существующих пород животных, сортов растений и штаммов микроорганизмов. Методы селекции Гибридизация — получение гибридов от скрещивания генетически разнородных организмов. Гибридизация может быть родственная (инбридинг) и неродственная (аутбридинг). Эффект гетерозиса — явление повышения жизнеспособности и продуктивности у гибридов поколения по сравнению с исходными родительскими формами (гибридная мощь). Искусственный отбор — процесс создания новых организмов с хозяйственно-ценными для человека признаками и свойствами путём систематического сохранения и размножения в ряду поколений особей с данными характеристиками. Различают два вида искусственного отбора — бессознательный (ведущийся без определённого плана) и методический (производится с определённой целью, применим в форме массового (микроорганизмы) и индивидуального (животные и самоопыляющиеся растения) отбора). Искусственный (экспериментальный) мутагенез — получение мутаций с помощью физико-химических агентов (ультрафиолетовое и рентгеновское излучение). В сфере достижений селекционной науки лежит разработка и практическое применение гибридизации – скрещивания организмов различных типов и инбридинга. Это необходимо для выведения чистой наследственной линии при близкородственном скрещивании. Инновационные методики селекционной работы - клеточные, хромосомные и генные приемы инженерии. Микроорганизмы отличаются большой вариабельностью изменений, их биологические и морфологические признаки поражают разнообразием. На сегодняшний день промышленным образом производится огромное количество полезных микроорганизмов, использующихся в пищевой промышленности, фармакологии, сельском хозяйстве. Основные приемы, которые используются в сфере селекции бактерий, представляют собой биотехнологический комплекс. Это разновидности отбора, гибридизации, мутагенеза, клеточной и генной инженерии. Мутагенез. Понятие. Сущность. Практическое значение. Мутагенез – это метод воздействия на клетки различными мутагенами: химические вещества, облучение радиацией и т. д. Эти воздействия изменяют структуру ДНК, и, соответственно, свойства организма. Вредные изменения выбраковываются, а полезные закрепляются и используются в селекции. В селекции микроорганизмов в основе своей применяют метод мутагенеза. Мутагены изменяют структуру ДНК прокариот, появляются мутантные бактерии с новым характером белков, а значит и признаков. Практическое значение мутагенеза заключается в создании микроорганизмов с новыми свойствами. Мутанты, используемые для достижения сверхсинтеза конечных продуктов. Используют ауксотрофных мутантов. Производят ауксотрофные мутанты с помощью мутагенов. После воздействия мутагена на клетку продуцента у полученных мутантов определяют потребность в питательных веществах и идентифицируют мутанты, нуждающиеся в веществе, синтез которого должен быть блокирован. Затем у ауксотрофных мутантов оценивают способность продуцировать желаемую аминокислоту, и наиболее продуктивный вариант используют в промышленном производстве. По этой схеме получен мутант C. glutamicum для производства лизина. Виды внутриклеточной регуляции метаболизма микроорганизмов (регуляция метаболитами, ферментная и генная регуляции). Характеристика. Выделяют следующие виды внутриклеточной регуляции: 1) регуляция метаболитами:при постоянном количестве ферментов и соотношении их активностей изменяется концентрация промежуточных продуктов метаболизма, что определяет тот или иной путь обмена, например, регуляцию дыхания. 2) ферментная регуляция: осуществляется путем изменения активности ферментов без изменения их количеств, при этом на молекулы ферментов действуют регулирующие факторы. Каталитическая активность может увеличиваться под влиянием положительного эффектора –активатора или уменьшаться под действием отрицательного эффектора –ингибитора. Ферменты, занимающие ключевые позиции в биосинтезе, в большинстве случаев являются регуляторными. У регуляторных ферментов кроме каталитических центров, предназначенных для связывания субстрата, есть аллостерические центры– места связывания активаторов и ингибиторов. Если конечный продукт того или иного метаболического пути начинает накапливаться в клетке в количествах, превышающих ее потребности, он может действовать как аллостерический ингибитор, что приводит к ингибированию активного фермента. В результате уменьшается или даже приостанавливается дальнейшее образование самого конечного продукта (ингибирование конечным продуктом или ретроингибирование). Механизм аллостерического ингибирования состоит в том, что конечный продукт связывается с регуляторным (аллостерическим) центром фермента. В результате происходит изменение структуры белка. Оно передается активному центру, влияя, таким образом, на каталитическую активность фермента. 3) генная регуляция: происходит изменение количества ферментов, при этом регулирующие факторы влияют на биосинтез или распад ферментов. В клетках микроорганизмов многие ферменты синтезируются непрерывно вне зависимости от субстрата –конститутивные ферменты (участвуют в обменных процессах). Другие ферменты образуются только в присутствии определенных веществ –индукторов. Примером индуцебельных ферментов являются гидролазы, амилазы, целлюлазы. Образование ферментов, участвующих в биосинтезе, регулируется посредством репрессии. Индуктор взаимодействует в клетке с репрессором, инактивирует его, в результате включается генетический аппарат клетки и начинается синтез фермента. Аминокислоты: характеристика, классификация, сферы практического применения. Аминокислоты относятся к группе карбоновых кислот, содержащих одну или несколько аминогрупп -NH2. Общая формула аминокислот - RCH(NH2)COOH (за исключением пролина и оксипролина). Аминокислоты играют большую роль в здравоохранении, животноводстве, легкой промышленности. Аминокислоты являются основой всех природных белков и служат составной частью пищи человека и кормовых рационов животных. Природные белки состоят из 20 аминокислот. Физиологическое значение аминокислот неодинаково. Одни из них не синтезируются с достаточной скоростью и в необходимом количестве в организме человека и животных, а потому должны поступать вместе с продуктами питания. Это так называемые незаменимые аминокислоты. К ним относятся валин, аргинин, гистидин, лизин, лейцин, изолейцин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин. Нормальный обмен веществ в организме человека и животных протекает только при поступлении в него незаменимых аминокислот в достаточном количестве и определенном соотношении. Недостаток даже одной из незаменимых аминокислот может привести к серьезному нарушению обмена веществ в организме, к замедлению его роста и развития. Аминокислоты широко используются во многих отраслях промышленности, что определяет высокий уровень их производства - порядка 500 тыс. тонн в год. Наибольшее количество производимых аминокислот (около 66%) используется в сельском хозяйстве в качестве добавки к кормам. Кроме сельского хозяйства, одним из главных потребителей аминокислот является пищевая промышленность - около 31%. Аминокислоты используются как обогатители пищевых растительных продуктов для повышения их питательной ценности, а также в качестве приправ, так как они обладают вкусовыми свойствами и могут придавать продукту определенный аромат и вкус. Способы получения аминокислот, их сравнительная характеристика. Исходные продукты, условия, достоинства и недостатки. В настоящее время существуют четыре способа получения аминокислот: 1) выделение из гидролизатов природного белоксодержащего сырья; 2) химический синтез; 3) химико-энзиматический синтез; 4) микробиологический синтез. Первый способ в настоящее время почти не используется, поскольку имеет ряд недостатков: дефицит природного белкового сырья и трудоемкость процесса разделения смеси аминокислот. При химическом синтезе образуются в основном рацемические смеси L- и D-форм аминокислот, которые сложно разделить на отдельные соединения. Химико-энзиматический метод - в результате химических реакций получают предшественники аминокислот, затем проводят трансформацию с помощью ферментных систем соответствующих микроорганизмов. Однако субстратная специфичность ферментов, их ограниченная доступность, сложность их выделения и очистки ограничивают их применение для этих целей. Несмотря на то что ферментативные синтезы преодолевают все вышеперечисленные проблемы, низкий выход очищенных ферментов лимитирует использование химико-ферментативных реакций. Микробиологический синтез лишен многих недостатков в связи с тем, что природные аминокислоты являются, как правило, оптически активными L-формами. Микробиологический метод получения L-лизина, триптофана. В настоящее время большинство продуцентов L-лизина относится к группе Corynebacterium. Существуют два способа промышленного получения лизина с помощью микроорганизмов: двухступенчатый и одноступенчатый. Двухступенчатый способ предусматривает использование в качестве основного сырья предшественников L-лизина, полученных химическим или биологическим методом. В качестве предшественников могут быть использованы L- и DL-диаминопимелиновая кислота, DL-5 (4-аминобутил) гидантоин, 5-формил-2-оксивалериановая кислота, L-кетоадипиновая кислота, L- и DL-аминокапролактам, DL-аспараги-новая кислота. На первой ступени производства получают или готовят предшественник, а также ферментный препарат, с помощью которого его трансформируют в L-лизин. Для этого выращивают биомассу микроорганизма, обладающего требуемым комплексом ферментов, которую отделяют от культуральной жидкости и используют непосредственно для трансформации. Второй ступенью является собственно процесс трансформации предшественника с помощью ферментов, заключенных в биомассе микроорганизма, в L-лизин. В качестве продуцентов нужного комплекса ферментов используют Cor. glutamicum, Br. flavum, Sacch. cere-visiae и др. Одноступенчатый способ получения L-лизина заключается в выращивании на специально подобранной питательной среде микроорганизма, обладающего способностью к сверхсинтезу L-лизина, ауксотрофного мутанта с нарушенным синтезом гомосериндегидрогеназы, способного образовывать лизин свыше 40 г/л. Для промышленного получения L-лизина можно также использовать мутанты с нарушенным синтезом гомосеринкиназы, которые образуют до 15-26 г/л лизина. Для производства триптофана применяют как одноступенчатый синтез с помощью бактериальных ауксотрофных мутантов с нарушенной регуляцией синтеза аминокислот, так и двухступенчатый синтез, включающий вначале получение предшественника триптофана, а затем его ферментативное превращение в конечный продукт - триптофан. У бактерий и у других организмов триптофан образуется из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпировиноградной кислоты через ряд последовательных реакций, включающих образование шикимовой и хоризмовой кислот, а непосредственным предшественником триптофана является антраниловая кислота. Синтез триптофана аллостерически ингибируется конечными продуктами, которые действуют на ферменты, катализирующие начальные этапы превращений, связанные с образованием хоризмовой кислоты. Для смещения метаболических реакций по пути преимущественного образования триптофана необходимо блокировать превращение хоризмовой кислоты в префеновую, что достигается действием мутагенных факторов. У мутантов с пониженной активностью ферментов, катализирующих превращение хоризмовой кислоты в префеновую, наблюдается повышенный синтез триптофана, но для нормального развития этих мутантов, в питательную среду необходимо добавлять дефицитные аминокислоты - фенилаланин и тирозин - в количествах, не вызывающих регуляторное ингибирование ферментов синтеза триптофана. Для промышленного получения триптофана разработаны технологии на основе использования ауксотрофных мутантов: бактерий рода Bacillus subtilis с нарушенным синтезом фенилаланина и тирозина. Все технологические процессы организованы примерно по той же схеме, что и получение лизина с помощью мутантных штаммов коринебактерий. Особенности получения аргинина микробиологическим способом. Биосинтез лизина у различных микроорганизмов протекает по – разному. Существуют два различных пути синтеза лизина. Один начинается с 2 – кетоглутаровой через 2 – аминоадипиновую кислоту. По этому пути лизин образуется в клетках дрожжей, грибов, актиномицетов и некоторых видов водорослей. Регуляция биосинтеза L – лизина по аминоадипиновому пути идет по первому ферменту, катализирующему превращение 2 – кетоглутаровой кислоты в гомолимонную, так как избыток лизина в среде тормозит образование последней. Второй путь начинается с аспаргиновой кислоты и проходит через 2,6 – диаминопимелиновую кислоту. Этот путь проходит в бактериальных клетках. Эта сложная схема образования L – лизина расшифрована при использовании мутантов, дефицитных по различным ферментам в цепи превращения аспарагиновой кислоты до L – лизина. Аспарагиновая аминокислота под действием фермента β – аспартаткиназы превращается в β – фосфоаспартат, а далее в аспартат – 3 – полуальдегид – промежуточный метаболит. Из него могут синтезироваться пять аминокислот: лизин, гомосерин, метионин, треонин и изолейцин. Особенности химико-ферментативного способа получения аминокислот (триптофан, L-лизин). Этот метод получения аминокислот состоит из двух этапов. Сначала химическим способом синтезируется «предшественник» - соответствующая карбоновая кислота, затем эта кислота превращается в соответствующую аминокислоту. Эта биоконверсия осуществляется ферментами живых клеток. Этим методом можно производить практически все аминокислоты, но из – за дороговизны и сложности получения органических кислот – предшественников этот метод не всегда экономически выгоден. Как используются микроорганизмы для обнаружения аминокислот? Ответ никак.... Пиздец) ну можно предположить, конечно, основываясь на том, что избыток определенных аминокислот мешает образованию других аминокислот в культуре и таким образом мы сделаем вывод что эти аминокислоты там есть. Но ведь мы, итак, сами их туда добавили …?))) Моно- и комплексные лекарственные препараты на основе аминокислот. Характеристика (действие, применение). Глицин является регулятором обмена веществ, нормализует и активирует процессы защитного торможения в центральной нервной системе. Глицин обладает адреноблокирующим, антиоксидантным и антитоксическим действием, за счет чего уменьшает психоэмоциональное напряжение, агрессивность, конфликтность, улучшает настроение, повышает социальную адаптацию; повышает умственную работоспособность; Глутаминовая кислота способна служить защитным фактором при различных отравлениях печени и почек, усиливать фармакологическое действие лекарственных средств, ослаблять токсическое действие различных веществ. На этом основано ее широкое применение в медицине. L-орнитин-L-аспартат обладает детоксикационным действием, снижая повышенный уровень аммиака в организме, в частности, при заболеваниях печени. Действие препарата связано с его участием в орнитиновом цикле мочевинообразования Кребса (активирует работу цикла, восстанавливая активность ферментов клеток печени - орнитин-карбамоилтрансферазы и карбамоилфосфатсинтетазы). Аргинина глутамат — соединение аргинина и глутаминовой кислоты, которые играют важную роль в обеспечении биохимических процессов нейтрализации и выведения из организма высокотоксичного метаболита обмена азотсодержащих веществ — аммиака. Гипоаммониемический эффект препарата реализуется в результате активации процессов обезвреживания аммиака в орнитиновом цикле синтеза мочевины, связывания аммиака в нетоксичный глутамин, а также усиления выведения аммиака из ЦНС и его экскреции из организма. Благодаря этим свойствам аргинина глутамат снижает общетоксическое, а также нейротоксическое действие аммиака. Способствует выработке инсулина и соматотропного гормона. Улучшает белковый обмен при заболеваниях, требующих парентерального питания. Способствует уменьшению астенического, диспептического и болевого синдромов, а также нормализации повышенной массы тела (при стеатозе и стеатогепатите). Витамины: характеристика, классификация, сферы практического применения. Витамины – низкомолекулярные органические соединения различной химической природы, необходимые для осуществления жизненно важных биохимических и физиологических процессов в живых организмах. Витамины, участвующие в биохимических процессах, являются либо предшественниками коферментов (витамин В1), либо представляют собой собственно коферменты (липоамид). Некоторые витамины обеспечивают протекание ряда физиологических процессов: витамин А2 участвует в процессе зрительного восприятия; витамин А3 – в процессе дифференцировки клеток; витамин D – в процессе формирования костной ткани; витамин Е выполняет функцию антиоксиданта. бывают: водорастворимые (В1, В2, В6, В9, В12, Р, РР, С) – они растворяются в воде и вода необходима для их усвоения организмом; жирорастворимые (А, Е, D, К) – для того чтобы они усвоились, необходим жир, так как они растворяются только в жирах. Традиционные методы получения (выделение из природных источников и химический синтез). 1. Экстракция витаминных препаратов из растительного или животного сырья. Этим способом были получены первые витаминные препараты. Например, каротин извлекали из моркови, витамин В12 - из сырой печени крупного рогатого скота. Однако в настоящее время метод неактуален ввиду ограниченности сырьевых ресурсов и очень низкого содержания витаминов в сырье природного происхождения. 2. Химический синтез витаминов. Производство витаминов путем химического синтеза занимает одно из ведущих мест в современной фармацевтической промышленности, однако данный способ производства витаминов представляет собой сложный многоэтапный процесс, сопряженный с большими производственными затратами, что делает конечные продукты слишком дорогими. 3. Биосинтез витаминов. Некоторые витамины, имеющие сложное строение, химический синтез которых в крупномасштабном производстве невозможен или экономически нецелесообразен, получают исключительно с помощью биосинтеза с применением микроорганизмов. Примером может служить производство витамина В12. Микробиологический синтез применяют также в получении витаминных концентратов, которые предназначены для сельскохозяйственной промышленности, поскольку в данном случае обычно в индивидуальном чистом виде витамины не выделяют. Следует отметить условность разделения на данные способы получения витаминов. Процесс производства некоторых витаминов включает как химические стадии, так и стадии биотрансформации с применением микроорганизмов (например, производство витамина С). Микробиологический синтез витаминов и конструирование штаммов-продуцентов методами генетической инженерии Микроорганизмы содержат много различных витаминов, которые чаще всего являются компонентами ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят от биологических свойств культуры микроорганизмов и условий их культивирования. Так, кормовые дрожжи, получаемые на гидролизатах древесины и углеводородах, сравнительно богаты витаминами группы В, биотином, фолиевой кислотой, никотиновой кислотой. Продукцию отдельных витаминов микроорганизмами можно увеличить путем изменений в составе питательной среды. Например, количество витамина В2 в биомассе дрожжей зависит от уровня железа в среде и интенсивности аэрации; повышенные дозы кобальта приводят к увеличению содержания витамина В6. Таким образом, при производстве витаминов ведущее место занимают химические и биотехнологические методы. Использование биотехнологических методов предпочтительнее ввиду ужесточения экологических требований к фармацевтическому производству. Кроме того, при применении биотехнологических методов появляются возможности сокращения части стадий химического синтеза за счет использования высокоактивных штаммов микроорганизмов-продуцентов. Например, производство витаминов В2, В3, В12 и D осуществляют в одну стадию. Производство витамина B12 основано, главным образом, на культивировании пропионовокислых бактерий. У нас в стране в качестве продуцента витамина B12 применяют Propionibacterium shermanii. Преимущество получения витамина B12 про-пионовокислыми бактериями заключается в том, что они синтезируют исключительно истинный витамин B12. В результате поиска источников витамина В2 были предложены активные продуценты рибофлавина, в частности гриб Eremothecium ashbyii, обладающий способностью синтезировать до 25 кг витамина В2 при выращивании на 1 т питательной смеси. С целью получения значительного количества рибофлавина штаммы-продуценты обрабатывают мутагенами, нарушающими механизм ретроингибирования синтеза витамина В2, а также флавиновыми нуклеотидами. В качестве основной характеристики отбора мутантов используют устойчивость к розеофлавину - аналогу витамина В2. Штаммы, устойчивые к розеофлавину, обладают способностью к сверхсинтезу витамина В2. Биологическая роль ферментов. Применение ферментов. Основные классы ферментов. Номенклатура ферментов. Ферменты или энзимы (Е) — это специфические белки, содержащиеся во всех клетках организма человека и являющиеся биологическими катализаторами. Ферменты являются посредниками между организмом и окружающей средой, обеспечивают адаптацию организма к изменяющимся условиям (авторегуляторы). Номенклатура. 1.Тривиальные названия ферментов (пепсин, трипсин, химотрипсин). 2.Название субстрата + суффикс –аза (липиды – липаза, сахароза – сахараза, мальтоза – мальтаза). 3. По типу катализируемой реакции (дегидрирование – дегидрогеназа, карбоксилирование – карбоксилаза). Основой классификации ферментов служит тип катализируемой реакции. Согласно данной классификации ферменты делят на шесть классов: Оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции). Трансферазы (катализируют реакции межмолекулярного переноса атомов, групп атомов, радикалов). Гидролазы (катализируют расщепление внутримолекулярных связей органических молекул с участием воды). Изомеразы (катализируют взаимопревращения оптических и геометрических изомеров). Лиазы (катализируют разрыв связей С-О, С-С, С-N, а также обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов негидролитическим путем). Лигазы (катализируют синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ). Для каждой ткани (органа) характерен определённый ферментный состав (маркерные ферменты). Для сердечной мышцы маркерными ферментами являются - аспартатаминотрансфераза (АсТ), креатинкиназа; для печени – аланинаминотрансфераза (АлТ); для предстательной железы – кислая фосфатаза ( КФ); для поджелудочной железы – α-амилаза и т.д. При заболеваниях, сопровождающихся некрозом, маркерные (органоспецифичные) ферменты из повреждённых клеток в большом количестве поступают в кровь, и уровень их активности увеличивается, возникает гиперферментемия. Определение уровня активности маркерных ферментов в сыворотке крови имеет клиническое значение в диагностике и прогнозе ряда заболеваний. Так, при инфаркте миокарда увеличивается уровень активности АсТ, креатиназы; вирусном гепатите – АлТ; раке предстательной железы – кислой фосфатазы; при заболеваниях поджелудочной железы – α-амилазы и т.д. Важнейшие свойства ферментов. Преимущества ферментных катализаторов перед химическими. Специфичность, лабильность, способность ферментов к регуляции. Ферменты обладают специфичностью. Различают несколько видов специфичности: Абсолютная специфичность – фермент взаимодействует только с одним субстратом. Например, уреаза ускоряет гидролиз мочевины, но не расщепляет тиомочевину. Стереоспецифичность – фермент взаимодействует с определенным оптическим и геометрическим изомером. Абсолютная групповая специфичность – ферменты специфичны в отношении характера связи, а также тех соединений, которые образуют эту связь. Например, α-амилаза расщепляет α-гликозидную связь в молекуле мальтозы, состоящей из двух молекул глюкозы, но не расщепляет молекулу сахарозы, состоящую из молекулы глюкозы и молекулы фруктозы. Относительная групповая специфичность. В этом случае ферменты специфичны только в отношении связи, но безразличны к тем соединениям, которые образуют эту связь. Например, протеазы ускоряют гидролиз пептидных связей в различных белках, липазы ускоряют расщепление сложноэфирных связей в жирах. Преимущества ферментов перед катализаторами: 1. Скорость ферментативных реакций выше, чем реакций, катализируемых неорганическими катализаторами. 2. Ферменты обладают высокой специфичностью к субстрату. 3. Ферменты по своей химической природе белки, катализаторы - неорганика. 4.Ферменты работают только в определенном диапазоне температур, а скорость неорганического катализа возрастает в 2-4 раза при повышении температуры на каждые 10 град. С по линейной зависимости (правило Вант-Гоффа) . 5. Ферменты подвержены регуляции (есть активаторы и ингибиторы ферментов) , неорганические катализаторы работают нерегулируемо. 6. Ферменты обладают конформационной лабильностью - способностью к небольшим изменениям своей структуры за счет разрыва и образования новых слабых связей. 7. Ферментативные реакции протекают только в физиологических условиях, т. к. работают внутри клеток, тканей и организма (это определенные значения температуры, давления и рН). Источники ферментов. У человека и высших млекопитающих ферменты выделяются клетками ПЖЖ в кишечник, где белки и полисахариды разлагаются на моносахара и аминокислоты и легко усваиваются клетками макроорганизма. Из ПЖЖ свиньи выделен «секрет» (комплекс ферментов), который в высушенном и измельченном виде стали применять при нарушении пищеварения. Выделение этого комплекса ферментов из органа животного считают первым примером выделения и практического использования ферментов. Первыми источниками сырья, из которых стали выделять ферменты, являются различные органы животных (ПЖЖ, слизистые оболочки желудка и тонких кишок свиней, сычуги крупного рогатого скота, сычужки молочных телят и ягнят, семенники половозрелых животных). ПЖЖ содержит большое количество разнообразных ферментов: химотрипсин, коллагеназу, эластазу, трипсин, амилазу, липазу и др. Слизистая оболочка желудка свиней и сычуг крупного рогатого скота служат источником пепсина и липазы. Из сычужков молочных телят и ягнят получают реннин (сычужный фермент). Семенники половозрелого скота содержат фермент гиалуронидазу. На всех крупных мясокомбинатах имеются цеха по сбору и заморозке органов убойных животных для последующего получения из них ферментных препаратов. Безусловно, большое количество ферментов содержится и в клетках растений. Однако выделение из них ферментов в промышленном масштабе экономически невыгодно, поскольку носит сезонный характер и требует затрат на переработку большого количества сырья. В то же время в США, например, до сих пор ежегодно перерабатывают до 100-200 т плодов дынного дерева (папайи) для получения папаина. Этот фермент используют для обработки - тендеризации, размягчения мяса при изготовлении сырокопченых колбас. Производство ферментов микробиологического происхождения. Технология культивирования микроорганизмов-продуцентов ферментов. Получение посевного материала. В качестве продуцентов ферментов используют микроскопические грибы, бактерии, дрожжи. В промышленном производстве ферментов используют плесневые грибы рода Aspergillus и бактерии рода Bacillus. Требования, предъявляемые к продуцентам ферментов: ► должны синтезировать в больших количествах преимущественно один фермент и минимум - другие; ► не должны продуцировать аллергенные и токсичные субстанции; ► должны хорошо развиваться в крупномасштабных ферментаторах. Технология микробных ферментных препаратов относится к типичным микробиологическим производствам. В настоящее время культивирование микроорганизмов-продуцентов ферментов осуществляется двумя способами: поверхностной и глубинной ферментацией. Методы культивирования (поверхностный, глубинный, проточный). При поверхностном методе выращивания культура (в основном грибы) растет на поверхности твердой увлажненной среды, содержащей отруби, отходы пищевой и сельскохозяйственной промышленности (кочерыжки, солома, опилки, жмыхи). Для повышения активности некоторых ферментов к отрубям добавляют определенные компоненты. Для получения рыхлой структуры к среде добавляют древесные опилки, солодовые ростки, овсяную шелуху. Рыхлая структура среды необходима для обеспечения микроорганизмов кислородом. Глубинный метод культивирования имеет ряд преимуществ перед поверхностным: ► можно изменять состав среды, обеспечивая максимальный выход того или иного фермента; ► исключает ручной труд. Однако при поверхностном методе культивирования микроорганизмов достигается более высокая конечная концентрация фермента на единицу массы среды. Глубинный метод культивирования заключается в выращивании микроорганизмов (бактерий и актиномицетов) в жидкой питательной среде. Технологические схемы при глубинном способе культивирования в этом случае почти не отличаются от тех, что используются при получении других биологически активных веществ (антибиотиков, органических кислот и др.). Он включает получение посевного материала, приготовление и стерилизацию питательной среды и выращивание продуцента в производственных ферментаторах. Принцип непрерывного (проточного) культивирования микробов состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно втекает такой же объем культуры. По такому принципу организуются две разновидности технического процесса непрерывного культивирования: процесс (технология) полного вытеснения и технология полного смещения. Требования к качеству питательной среды (механизм катаболитной репрессии). Катаболитная репрессия – механизм регуляции, с помощью которого происходит снижение активности ферментов утилизации вторичных источников углерода при наличии основного источника углерода. Обеспечивает предпочтительное использование глюкозы по сравнению с другими источниками углерода. Готовые питательные среды должны: удовлетворять потребностям обмена веществ микробной клетки; легко усваиваться бактериями; содержать необходимые соли (NaCl,K,Mg,Ca); быть стерильными; иметь оптимальную рН; иметь достаточную влажность (плотная среда должна иметь не меньше 60% влаги); содержать факторы роста. Технология выделения и очистки ферментных препаратов (получение неочищенных и очищенных ферментных препаратов). Выделение и очистка ферментов - трудоемкий и дорогостоящий процесс. Именно поэтому в некоторых случаях ферментные препараты применяют в неочищенном виде - в кожевенной, спиртовой промышленности, в сельском хозяйстве. Однако в пищевой промышленности, в микробиологических производствах и особенно в медицине могут использоваться только ферменты высокой степени очистки. Для очистки ферментных препаратов используют различные методы. 1. Методы осаждения: ► органическими растворителями; ► высококонцентрированными растворами солей. 2. Сорбционно-хроматографические методы: ► ионообменная хроматография; ► аффинная хроматография; ► гельфильтрация и др. 3. Мембранные методы очистки: ► диализ; ► электродиализ; ► обратный осмос; ► ультрафильтрация; ► диафильтрация. Особенности проведения аффинной хроматографии для очистки ферментов. Суть метода • Выделение ферментов основано на их специфическом взаимодействии с лигандами, ковалентно связанными с нерастворимым носителем. • Сорбентом в этом случае служит гель, к которому присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. •Когда раствор, содержащий фермент, пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом (т.е. фермента с его субстратом) приводит к его удерживанию и к концентрированию. •Поскольку сорбция носит обратный характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Хранение и стабилизация ферментных препаратов. Для получения постоянной активности в препараты вводится наполнитель в определенном количестве, которое зависит от полученной на данном предприятии активности в культуре и препарате. Желательно, чтобы наполнитель по отношению к ферменту выступал и в роли стабилизатора, а не просто инертного соединения. Проблема нестабильности решена путем создания так называемых «промышленных биокатализаторов» - иммобилизованных ферментов. В данном случае под иммобилизацией подразумевают связывание фермента с нерастворимым носителем при сохранении каталитической активности фермента. Инженерная энзимология и ее задачи. История развития инженерной энзимологии. Инженерная энзимология - это одно из направлений в биотехнологии, которое основано на использовании ферментов (или ферментных систем), в изолированном виде или в структуре живых клеток, в качестве катализаторов с целью получения определенных целевых продуктов. Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использования. Принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией в 60-е года ХХ века в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли – инженерной энзимологии. Ее задачи заключаются в развитии прогрессивных методов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации, конструировании катализаторов с нужными свойствами и разработке научных основ их применения. Важным этапом развития инженерной энзимологии стала разработка способов получения и использования иммобилизованных ферментов. Задачи инженерной энзимологии – конструирование органических катализаторов с заданными свойствами на основе ферментов и полиферментных систем, выделенных из клеток или находящихся в них. Преимущества использования иммобилизованных биообъектов в условиях производства. Иммобилизованные ферменты обладают рядом преимуществ: ► являясь гетерогенными катализаторами, с легкостью отделяются от реакционной среды, могут использоваться неоднократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса; ► процесс иммобилизации ведет к изменению свойств фермента, что позволяет регулировать субстратную специфичность, устойчивость, зависимость активности от условий среды; ► иммобилизованные ферменты долговечны и во много раз стабильнее свободных энзимов. Требования к носителям для иммобилизации ферментов. Классификация и характеристика носителей. Материалы, используемые в процессе иммобилизации ферментов, должны обладать следующими характеристиками: высокой биологической и химической стойкостью, нерастворимостью, гидрофильностью, проницаемостью для ферментов и коферментов, субстратов и продуктов реакции, быстрой активацией носителя (переход в реакционно-способную форму). Органические полимерные носители. Все органические полимерные носители, которые существуют на данный момент, можно разделить на синтетические и природные. Следует отметить, что синтетические и природные носители дополнительно подразделяют в зависимости от их строения. Среди природных полимеров выделяют липидные, белковые и по-лисахаридные носители, а среди синтетических - полиамидные, по-лиметиленовые и полиэфирные. Природные носители обладают рядом преимуществ, а именно полифункциональностью, доступностью и гидрофильностью, но наряду с этим имеют и недостатки - био-деградируемость и высокую стоимость. Носители неорганической природы. В качестве неорганических носителей чаще всего применяют материалы из глины, стекла, керамики, силикагеля, графитовой сажи; кроме этого, могут использоваться силохромы и оксиды металлов. Особенностью неорганических носителей является то, что они могут быть подвержены химической модификации, с этой целью они покрываются пленкой оксидов алюминия, циркония, титана или обрабатываются органическими полимерами. Следует отметить, что основным преимуществом неорганических носителей является легкость регенерации; кроме этого, подобно синтетическим полимерам, они могут быть произведены в любой форме и получить их можно с разной степенью пористости. Методы иммобилизации ферментов (физические и химические). Охарактеризуйте их. Реализация физических методов иммобилизации ферментов осуществляется посредством адсорбции энзима на нерастворимом носителе путем включения его в поры поперечно-сшитого геля, в полупроницаемые структуры или двухфазные системы. Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. При адсорбционной иммобилизации молекула белка удерживается на поверхности носителя за счет гидрофобных, электростатических, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Для определения эффективности адсорбции белковой молекулы на носителе необходимо учитывать удельную поверхность (плотность центров сорбции) и пористость носителя. Следует отметить, что процесс адсорбции ферментов на носителях, относящихся к нерастворимым, крайне прост и достигается при контакте водного раствора энзима с носителем. При таком варианте иммобилизации активность фермента сохраняется практически на уровне 100%. Иммобилизация ферментов путем включения в гель. Данный способ иммобилизации широко распространен благодаря своей уникальности и простоте. Метод применяют для иммобилизации индивидуальных ферментов, мультиэнзимных комплексов и интактных клеток. Иммобилизация ферментов путем включения в гель осуществляется в основном двумя способами. В первом случае в водный раствор мономера вводят энзим, а затем осуществляют полимеризацию, результатом которой является образование пространственной структуры полимерного геля, в ячейки которого включены молекулы фермента. Во втором случае энзим вносят в уже готовый полимерный раствор, который впоследствии переводят в состояние геля. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, силикагеля, для второго - гели крахмала, карраги-нана, агар-агара, фосфата кальция, агарозы. Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры. Отделение водного раствора фермента от водного раствора субстрата с использованием полупроницаемой мембраны, которая пропускает низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, задерживая большие молекулы энзима, является основой иммобилизации ферментов в полупроницаемые структуры. Большой интерес представляют микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы. Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов путем возникновения ковалентных связей между энзимом и носителем обеспечивает необратимую и прочную связь фермента с носителем и в большинстве случаев сопровождается стабилизацией фермента. Следует отметить, что локализация энзима относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. В процессе отделения фермента от носителя используется вставка (спейсер, сшивка), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, глутаровый ди-альдегид, гидразин и др.). В этом случае структура фермента, подвергшегося иммобилизации, включает носитель, вставку и фермент, которые между собой соединены ковалентными связями. Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток. На настоящий момент в мировой практике созданы следующие крупномасштабные производства, в которых используют иммобилизованные ферменты и клетки: 1) получение глюкозо-фруктозных сиропов; 2) получение оптически активных L-аминокислот из рацемических смесей; 3) синтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония; 4) синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты; 5) синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты; 6) получение безлактозного молока; 7) получение сахаров из молочной сыворотки; 8) получение 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). жүктеу/скачать 43,57 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|