7.2. NO-синтаза
7.2.1. Строение и механизм действия NO-синтазы
Молекула NO-синтазы (NOS) состоит из двух идентичных
субъединиц, то есть является гомодимером. В каждой субъеди-
нице различают два домена — оксигеназный (окислительный)
на N-конце и редуктазный (восстановительный) на С-конце.
В качестве мостика между доменами выступает кальмодулин-
связывающий участок. N-концевой домен оксигеназы содержит
сайты связывания аргинина (субстрат-связывающий центр), гема
(осуществляет перенос электронов) и тетрагидробиоптерина
(H
4
B) — кофермента, который, по-видимому, участвует в пере-
носе отщепляемой от аргинина группы. С-терминальный редук-
тазный домен содержит три функциональных центра: никотина-
мидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН), флавинадениндину-
клеотид (ФАД), флавинмононуклеотид (ФМН). Фермент активен
только после димеризации субъединиц, которая инициируется
связыванием одной молекулы кальмодулина с каждым мономе-
ром (рис. 40).
84
Димер фермента стабилизируется ионом цинка, который
тетраэдрически окружен четырьмя остатками цистеина. В ре-
зультате формируется так называемый цинк-тиолатный кластер,
в образовании которого участвует мотив Cys- Х–Х-Х–Х-Cys каж-
дого из мономеров NO-синтазы. Стоит отметить, что ион цинка
в данном случае играет структурную, а не каталитическую роль
(Chreifi et al., 2014; Hemmens et al., 2000; Li et al., 1999).
Оксигеназный домен по структуре и функции напоминает
цитохром Р450, а редуктазный — цитохром Р450-редуктазу (она
также содержит ФАД, ФМН и передает электроны от НАДФН
на гем цитихрома Р450). В случае же NO-синтазы в структуре
и функционировании фермента есть и свои особенности: NOS
имеет дополнительный функциональный центр, с которым свя-
зывается H
4
B; фермент содержит кальмодулин и, следовательно,
активируется ионами Са
2+
; в отсутствие ионов Са
2+
NO-синтаза
(кроме одной из ее изоформ) не содержит кальмодулин и практи-
чески неактивна.
Редуктазный домен осуществляет перенос электронов
от НАДФН на ФАД, далее на ФМН в оксигеназном домене, ко-
торый катализирует основную реакцию. На первой стадии про-
исходит гидроксилирование аргинина с образованием гидрок-
сиаргинина, окисляющегося на следующей стадии до оксоарги-
нина. При расщеплении последнего происходит освобождение
NO и образование промежуточного карбодиимида, который
Рис. 40. Строение гомодимераNO-синтазы
85
гидролизуется до цитруллина (Stuehr et al., 2001). На 1 моль обра-
зовавшегося NO расходуется 2 моль О
2
и 1,5 моль восстановлен-
ного НАДФH (рис. 41).
Таким образом, суммарная реакция образования NO выгля-
дит следующим образом:
Существенное значение для реализации этого процесса име-
ет связывание с оксигеназным доменом тетрагидробиоптерина.
Как установлено при детальном изучении кристаллов фермента,
H
4
B необходим для сближения кислорода, связанного с желе-
зом гема, с гуанидиновой группой аргинина. Белок кальмодулин
необходим для проявления ферментом каталитической активно-
сти (Alderton et al., 2001; Forsterman et al., 2012).
7.2.2. Изоформы NO-cинтазы
NO-синтаза присутствует не во всех клетках. Известны
три изоформы NOS: эндотелиальная, нейрональная и макро-
фагальная.
Рис. 41. Образование оксида азота в результате окисления
аргинина NO-синтазой
86
Две изоформы фермента конститутивны, то есть постоян-
но присутствуют в эндотелии сосудов (еNOS) и нервной системе
(nNOS). Их клеточная активность регулируется внутриклеточ-
ной концентрацией кальция. Третья изоформа — индуцибельная
(iNOS); она появляется при воспалительных, иммунных и не-
которых других реакциях в макрофагах, а по некоторым дан-
ным — и в ряде прочих клеток (например в гепатоцитах). iNOS
менее зависима от концентрации ионов Ca
2+
в клетке. Если свя-
зывание кальмодулина с конститутивными изоформами и, соот-
ветственно, их активация происходят лишь при повышении кон-
центрации ионов Ca
2+
, то индуцибельная изоформа связывается
с кальмодулином и при фоновой концентрации ионов Ca
2+
(ме-
нее 40 нМ). Это происходит благодаря высокому сродству iNOS
к кальмодулину (Cho et al., 1992; Hemmens et al., 2000).
Нейрональная NO-синтаза. Каждый мономер фермента со-
держит N-концевой домен PDZ, который отвечает за связывание
с мембранными гликопротеиновыми комплексами, что необхо-
димо для синаптической компартментализации фермента в ней-
ронах и его ассоциации с сарколеммой в скелетных и сердечной
мышцах. Функции нейронального NO чрезвычайно разнообраз-
ны: он контролирует осцилляторную активность нейронов, явля-
ется медиатором ноцицепции, термогенеза, обоняния, принятия
пищи и воды, снижает тревожность, регулирует выход нейроме-
диаторов, участвует в процессах координации и баланса, играет
значительную роль в процессах обучения и памяти. NO, проду-
цируемый в мозге, — это один из важнейших рычагов, с помо-
щью которых нервная система управляет тонусом сосудов, снаб-
жающих кровью все системы организма (Izumi et al., 1993; Тoda et
al., 2009; Zhou et al., 2009).
Эндотелиальная NO-синтаза. Каждая субъединица фермен-
та содержит М-концевой участок присоединения гидрофобного
остатка миристиновой кислоты, с помощью которого происходит
прикрепление фермента к внутренней поверхности плазматиче-
ской мембраны эндотелиальных клеток. NO, образованный eNOS,
участвует в регуляции тонуса кровеносных и лимфатических со-
судов, а также в предупреждении тромбообразования (Fleming et
al., 2010; Rudic et al., 1998; Walter et al., 2009).
Индуцибельная NO-синтаза. Для iNOS характерна делеция
аминокислотной последовательности, примыкающей к центру
связывания кальмодулина. Выпадение этой последовательности
Та
бл
иц
а 3
Достарыңызбен бөлісу: |