В данном обзоре рассмотрены основные методы создания гетерологических биохимических путей в различных организмах, основные проблемы, воз- никающие при этом, и основные подходы к их ре- шению
жүктеу/скачать 0,69 Mb. Pdf көрінісі
|
Лекция №6.1
| Интегративные векторы
Альтернативный подход к доставке гетерологиче- ских генов заключается в прямом включении био- синтетических генных кассет в геном хозяина. Большинство методов хромосомной интеграции ос- новано на процессах рекомбинации, транспозиции или вирус-опосредованной интеграции экзогенных геномов в ДНК хозяина [4]. При гомологичной рекомбинации используют экзо- генные векторы с целевыми генами, фланкированные сайтами рекомбинации хозяина. Эндогенные реком- биназы хозяина способствуют сайт-специфической интеграции генов-мишеней в хромосому гетерологи- ческого хозяина. Однако эффективность гомологич- ной рекомбинации существенно зависит от размера генной кассеты. Поэтому для успешной интеграции и экспрессии большого метаболического пути может потребоваться несколько последовательных этапов рекомбинации [48]. Для доставки генов на основе транспозиции ис- пользуются так называемые «прыгающие гены» – транспозоны, и фермент транспозаза, распознаю- щая специфические фланкирующие сайты целевой генной кассеты. Более длинные генные последова- тельности встраиваются менее эффективно, однако, в отличие от гомологичной рекомбинации, транспо- зоны встраиваются в случайные сайты, что приво- дит к различиям в уровне гетерологической экс- прессии разных клонов и позволяет выбирать клоны с оптимальной продукцией целевого метаболита [49]. К дополнительным преимуществам транспозонов от- носится универсальность плазмидной конструкции для нескольких хозяев [4]. Вирус-опосредованная система доставки генов ос- нована, в целом, на интегразах бактериофагов и со- ответствующих последовательностях интеграции. Поэтому во многих методах используют интегразу φC31 [50, 51], интегразу φBT1 [52, 53] или несколько интеграз [54]. Эти системы могут обеспечить эффек- тивную интеграцию в определенные места генома больших (до 100 т.п.н.) последовательностей, что по- зволяет осуществлять итеративную или одностадий- ную тандемную сборку фрагментов [52]. Очевидный изъян этой системы – потребность в специфическом молекулярном механизме, т.е. в интегразах и вспомо- гательных ферментах. Независимо от выбранного способа доставки ДНК следует обратить внимание на сами вводимые коди- рующие последовательности. Они могут быть полу- чены либо непосредственно из исходных организмов, либо синтезированы химически. Последний вариант более предпочтителен, так как он также позволяет оптимизировать содержание кодонов [2, 4], улучшая тем самым уровень экспрессии гетерологических ге- нов [25]. жүктеу/скачать 0,69 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|