В данном обзоре рассмотрены основные методы создания гетерологических биохимических путей в различных организмах, основные проблемы, воз- никающие при этом, и основные подходы к их ре- шению
ВЫБОР ХОЗЯИНА ДЛЯ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОЙ
жүктеу/скачать 0,69 Mb. Pdf көрінісі
|
Лекция №6.1
| ВЫБОР ХОЗЯИНА ДЛЯ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОЙ
ЭКСПРЕССИИ Выбор системы экспрессии для метаболического пути – одна из наиболее важных стадий разработки процесса с эффективной экспрессией [19]. Наиболее часто применяемые бактериальные системы экс- прессии удобны в использовании, требуют недорогих питательных сред и обеспечивают высокие уровни продукции рекомбинантных белков, для них разра- ботан набор инструментов для генетических и моле- кулярных манипуляций [20]. Однако в большинстве случаев из-за большого размера гетерологической биосинтетической генной кассеты и потребности Рис. 1. Типичная схема гетерологи- ческой экспрессии кластеров генов. А – выделение ДНК из нативного про- дуцента; Б – введение ДНК в векторы; В – отбор гете- рологического хозяина; Г – генетические манипуляции; Д – поддержание вектора в организ- ме гетерологиче- ского хозяина; Е – оптимизация производства ме- таболитов 30 | ACTA NATURAE | ТОМ 12 № 2 (45) 2020 ОБЗОРЫ в транскрипционном и/или посттрансляционном про- цессинге и модификациях чужеродных белков для ге- терологической экспрессии сложных метаболических путей бактериальные организмы-хозяева непригод- ны [19] или требуют дополнительных модификаций [21]. К счастью, системы экспрессии генов в дрож- жах и мицелиальных грибах, относительно дешевых, быстрорастущих и не требующих сложных условий культивирования организмов, зарекомендовали себя как надежные производители эукариотических бел- ков и метаболитов. Напротив, клеточные линии на- секомых и млекопитающих медленно растут, нуж- даются в особых условиях культивирования, имеют более низкие уровни экспрессии и требуют трудоем- кой адаптации для экспрессии метаболического пути. В таблице приведены некоторые преимущества и не- достатки широко используемых эукариотических си- стем экспрессии гетерологических генов. В качестве хозяев для гетерологической экспрес- сии широко используются одноклеточные эукари- отические микроорганизмы – дрожжи [22]. Помимо низких требований к условиям культивирования, дрожжи являются хорошим объектом для экспери- ментальных операций с использованием широкого спектра легкодоступных инструментов метаболиче- ской и генной инженерии. Также важно, что дрож- жевые клетки содержат молекулярную машине- рию, необходимую для фолдинга белков, способны выполнять самые сложные посттрансляционные модификации, необходимые для правильного функ- ционирования эукариотических ферментов, и могут поддерживать функциональную экспрессию фер- ментов, закрепленных в мембранах, например, ци- тохромов P450. Кроме того, дрожжам Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae присвоен статус «организ- ма, признанного безопасным» (GRAS), поскольку они Эукариотические хозяева, подходящие для гетерологической экспрессии Хозяин Преимущества Недостатки Типичные виды Дрожжевые культуры Неприхотливые быстрорастущие одноклеточные организмы Высокие уровни экспрессии белка Простое регулирование типа размножения клеток (половое или бесполое) Наличие типичных ферментов фолдинга белков и посттрансляционных модификаций Наличие надежных инструментов генетической манипуляции Способность экспрессировать мембранные ферменты и секретируемые белки Признаны безопасными (GRAS) (т.е. не вырабатывают высокотоксичных или онкогенных веществ) Потенциальное избыточное N-гликозилирование, способное привести к снижению функции белка Жесткая клеточная стенка Малое разнообразие нативных вторичных метаболитов, затрудняющее выбор надлежащих предшественников жүктеу/скачать 0,69 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|