Высшее образование

!Состав питательных сред, применяемых при культивировании клеток и тканей

жүктеу/скачать 5 Mb. бет 118/129 Дата 31.12.2021 өлшемі 5 Mb. #21358

Байланысты:
19b6c9a

Бұл бет үшін навигация:

• NH4NO3
• 6.3. ДВДИФФЕРЕНЦИРОВКА КАК ОСНОВА I КАЛЛУСОГЕНЕЗА |

!Состав питательных сред, применяемых при культивировании клеток и тканей (по Р. Г. Бутенко, 1999)
Концентрация питательных сред, мг/л
Компонент сред	Мурасиге и	Гамборга и	Уайта,	Нича и Нич,
	Скуга, 1962	Эвелега, 1968	1939	1974-1975
KN03	1900	3000	81	950
NH4NO3	1650	—	—	720
Ca(N03)2	—	—	142	—
Ca(N03)2-4H20	—	—	—	—
(NH4)2S04	—	134	—	—
MgS04-7H20	370	500	74	185
CaCl2H20		—	—	166
CaClr2H20	440	150	—	—
KC1		—	65	—
KH2P04	170	—	12	68
NaH2P04H20	—	150	—	—
MnS04H20	—	10	—	—
MnS0„-4H20	22,3	—	—	25
ZnS04-4H20	8,6	—	—	—
ZnS04-7H20	—	2	—	10
H3B04	6,2	3	—	10
CuS04-5H20	0,025	0,075	—	0,025
Na2Mo04-2H20	0,25	0,25	—	0,25
CoCl2-6H20	0,025	—	—	—
FeS04-7H20	27,8	—	—	27,8
Na EDTA-2H20	37,3	—	—	37,3
Секвестрен 330-Fe		28	—	—
Мезоинозит	100	—	—	200
Аскорбиновая кислота	—	—	—	3
Тиамин-HCl	0,5	—	—	3
Пиридоксин-HCl	0,5	—	—	1
Никотиновая кислота	0,5	—	—	—
Сахароза	30 000	20000	2000	60 000
Агар «Дифко», гель-	—	—	—	7000
рит, агароза

го синтеза. В качестве источника света используют люминесцент­ные лампы. Для большинства травянистых растений оптимум ос­вещенности составляет примерно 1000 люкс. Слишком низкая (300 люкс) или высокая (3000—10 000 люкс) освещенность подавляет рост. Освещение может влиять на метаболизм каллусных клеток. Так, в культурах чайного растения под действием света увеличивался биосинтез полифенолов. Напротив, в культуре клеток Scopolia parvi- flora свет подавлял образование алкалоидов. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенно­сти влияет качество света. Так, более 20 флавонов и флавоноловьп гликозидов образуется в культурах клеток петрушки после освеще­ния ее непрерывным люминесцентным светом «холодный белый» Вместе с тем синтез флавоновых гликозидов активируется при по­следовательном облучении ультрафиолетовым светом, а затем све­том, лежащим в области «красный—длинноволновый красный*

Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. В то же время каллусы и культуры клеток диос кореи дельтовидной хорошо растут даже при температуре 32 °С. В отличие от роста культур клеток и тканей индукция их морфоге­неза требует более низких температур (18 — 20 °С). Влияние тем­пературы на метаболизм клеток in vitro изучено слабо. Есть дан­ные, что в каллусных культурах максимальное образование алка­лоидов наблюдалось при температуре 25 °С, а при повышении тем­пературы резко снижалось. В суспензионных культурах клеток Ipomoea содержание жирных кислот значительно увеличивалось, если их выращивали при субоптимальных температурах роста (15 °С) Поэтому при выращивании культуры in vitro необходимо тща­тельно изучать влияние всех абиотических факторов, в том числе температурного, на рост и метаболизм клеток.

Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом куль­тивируемых клеток в больших объемах ферментеров.

При сравнении разных типов ферментеров было показано, что синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре был наи­большим при подаче воздуха снизу. При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.

Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где расту!, культуры, должна составлять 60 — 70%.

Таким образом, культивирование клеток и тканей зависит от мно­гих факторов внешней среды, и действие их не всегда хорошо изве? стно. Поэтому при введении в культуру нового вида растений необ-_т ходимо прежде всего тщательно изучить влияние физических фак торов на рост и физиологические характеристики этой культуры.

6.3. ДВДИФФЕРЕНЦИРОВКА КАК ОСНОВА I КАЛЛУСОГЕНЕЗА |

Культура изолированных тканей обычно представлена каллус ными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань об разуется в результате повреждения на целых растениях, а также J стерильной культуре на эксплантах — фрагментах ткани или орга на, используемых для получения первичного каллуса. Возникно­вение каллуса связано с неорганизованным делением (пролифе­рацией) дедифференцированных клеток. Дедифференцировка — основа создания каллусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться. Дедифференцировка — это возвращение клеток в меристематическое состояние, при кото­ром они сохраняют способность к делению. У интактных растений дедифференцировка и индукция каллусогенеза возникают вслед­ствие образования раневых гормонов (травматиновая кислота) при механическом повреждении. Обязательное условие дедифферен- цировки тканей экспланта и превращения их в каллусные клетки, помимо повреждения, — присутствие ауксинов и цитокининов. Среди ауксинов чаще всего используют 2,4-D (2,4-дихлорфенок- сиуксусную кислоту), ИУК (индолил-3-уксусную кислоту), НУК (а-нафтилуксусную кислоту), причем наибольшую активность проявляет 2,4-D. Из цитокининов в искусственные питательные среды обычно вносят кинетин, 6-БАП (6-бензиламинопурин), зеатин. Наиболее активны 6-БАП и зеатин. Функции этих двух групп гормонов в каллусогенезе разные, но они тесно связаны между собой. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, подготавливают ее к делению. Затем цитокинины инициируют деление клеток. Последние исследования свидетельствуют, что аук­сины индуцируют синтез главной протеинкиназы клеточного де­ления P₃₄^cdc2, а цитокинины — циклинов. Таким образом, дей­ствие этих гормонов проявляется только при последовательном или одновременном внесении их в среду. Кроме того, оно будет зависеть от физиологического состояния клеток экспланта, от их компетентности к действию тех или иных внешних факторов. Ре­зультаты исследований показали, что полисахариды и какие-то неизвестные индукторы тоже могут вызывать деление клеток, при­водящее к образованию каллуса.

Во время процесса дедифференциации, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные черты исходной ткани. В первую очередь они теряют запасные вещества — крахмал, бел­ки, липиды. В них разрушаются специализированные клеточные органеллы, в частности хлоропласты, но возрастает число ами- лопластов. Кроме того, разрушается аппарат Гольджи, перестраи­ваются эндоплазматический ретикулюм и элементы цитоскелета.

Через несколько часов после перенесения экспланта в условия in vitro начинается новый синтез белка. Он связан, вероятно, с механическим повреждением и действием гормонов, сохранив­шихся в экспланте с момента его изоляции из растения. Когда данные гормоны израсходуются, синтез белка прекращается. Если в это время клетки будут культивироваться на питательной среде, содержащей ауксины и цитокинины, то начнется каллусогенез, т.е. в результате дедифференцировки и деления клеток будет образовываться первичный каллус. Таким образом, специализи­рованная клетка растительной ткани становится каллусной в ре­зультате дедифференцировки, т.е. восстановления у нее способ­ности к делению.

6.4. ТИПЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

В зависимости от способа, условий культивирования и проис­хождения можно выделить несколько типов культур клеток и тка­ней. Если культивирование происходит поверхностно на агаризо- ванной питательной среде, то образуется каллусная ткань. Она не имеет четко выраженной структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определят, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плот­ной. Рыхлая каллусная ткань имеет сильно оводненные клетки, легко распадается на небольшие группы клеток и кластеры и по­этому может быть использована для получения суспензионной культуры. Ткань средней плотности характеризуется хорошо выра­женными меристематическими очагами. В ней легко инициируют­ся процессы органогенеза. Наконец, у плотных каллусных тканей различают зоны редуцированного камбия и трахеидоподобных элементов:

Культуры

сильно обводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки (получение суспензии)




Существует также суспензионная культура клеток, которую вы­ращивают в жидкой питательной среде, так называемое глубин­ное культивирование. Клеточные суспензии образуются как из каллусных тканей, так и непосредственно из экспланта. Для полу­чения суспензионных культур предпочтительнее брать каллусы рых­лого типа. Если для этой цели необходимо использовать плотный каллус, то его можно разрыхлить, исключив из питательной среды соли Са²⁺. С этой же целью можно культивировать ткань на среде, содержащей ауксин 2,4-D или ферменты — пектиназу (0,2 мг/л) и целлюлазу (0,01 мг/л). Наилучший эффект достигается при добав­лении ферментов. Суспензионные культуры клеток можно полу­чить и непосредственно из экспланта по методу Ф. Стюарда. Для этого эксплант помещают в жидкую среду при постоянном авто­матическом перемешивании. Дедифферениированные клетки от­рываются от экспланта, образуя суспензию в питательной среде. Постоянное встряхивание — необходимое условие культивирова­ния клеточных суспензий. Суспензионные клетки делятся в при­сутствии тех же двух групп гормонов (ауксинов и цитокининов), которые индуцируют деление клеток в каллусных тканях. Следо­вательно, можно сказать, что суспензионные культуры представ­лены разными агрегатами каллусных клеток.

Клеточные суспензии играют значительную роль в биотехноло­гии. Они могут быть использованы для получения изолированных протопластов, которые применяют для клеточной селекции, при введении чужеродных ДНК и других процессах. Клеточные суспен­зии культивируют в больших количествах для получения вторич­ных метаболитов, выявления новых веществ, для выращивания клеточной биомассы. Однако увеличение клеточной биомассы в результате деления клеток и синтез вторичных метаболитов разоб­щены во времени. Поэтому необходимо хорошо знать физиологию, свойства клеток в суспензионных культурах, чтобы получить макси­мальный выход продукта. Состояние клеточных суспензий характе­ризуется плотностью клеточной популяции. За 14 —16 дней (сред­няя длительность пассажа) плотность обычно повышается от 5-10⁴ до 5-10⁶ кл/мл. Качество суспензии определяется степенью агреги­рованное™. Агрегаты должны содержать не более 10 — 12 клеток.

Большой интерес представляет культура одиночных клеток. Ее применяют в клеточной селекции для отбора гибридных клеток и их клонирования, а также для генетических и физиологических исследований. Например, вопрос о причинах генетической неод­нородности легче решать, используя клон-потомство одной клет­ки, а не гетерогенную ткань исходного экспланта.

Однако культивирование одной или нескольких клеток связа­но с определенными трудностями, состоящими в том, что оди­ночная клетка живет, но не делится в тех условиях, которые раз­работаны для нормального роста и размножения клеток каллус - ной ткани. Поэтому при культивировании одиночных клеток по­требовалась выработка специальных методов. Все они основаны на использовании так называемого «кондиционирующего факто­ра» — метаболитов, выделяемых в среду делящимися клетками. Когда на питательную среду высаживается одна клетка или не­большое их количество, они не делятся, так как выделяемого кон­диционирующего фактора не хватает для индукции деления. Сле­довательно, необходимо повысить концентрацию фактора в пи­тательной среде. Этой цели служат следующие методы:

1. 
   Метод ткани-«няньки» — кондиционирующий фактор выде­ляется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками тка- ни-«няньки» (рис. 6.1).
   
2. 
   Метод «кормящего слоя» — кондиционирующий фактор вы­деляют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка (рис. 6.2).
   
3. 
   Кондиционирование среды — осуществляется путем добав­ления в нее питательной среды, отфильтрованной от интенсивно делящихся клеток.
   
4. 
   Метод культивирования одиночных клеток — осуществляется в микрокапле, т.е. в очень малом объеме (=20 мкл) богатой пита­тельной среды (Ю.Ю.Глеба).
   

Рис. 6.3. Доказательство химической природы фактора кондициониро­вания:

/ — одиночные клетки; 2 — ткань-«нянька»; 3 — делящиеся клетки; 4 — целло­фан; 5— стеклянные пластинки




разделить одиночные клетки и ткань-«няньку» стеклянной плас­тиной, то деления клеток не наступает. Если вместо пластин по­местить целлофан, то хотя и с задержкой начинается деление оди­ночных клеток (рис. 6.3).

6.5. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСНЫХ КЛЕТОК

Каллусная клетка имеет свой цикл развития, аналогичный циклу всех других клеток: деление, растяжение, дифференциров- ку, старение и отмирание. Дифференцировку каллусных клеток принято называть вторичной. Однако ее не следует путать с вто­ричной дифференцировкой, на которой основан морфогенез. Рост каллусных тканей подчиняется общим закономерностям. Кривая роста каллусных тканей также имеет характер ^-образной кривой (ростовая кривая Сакса) и включает пять фаз, длительность кото­рых неодинакова у разных видов растений (рис. 6.4).Первая фаза — латентная, или лаг-фаза, заключается в подготов­ке клеток к делениям. Вторая — фаза экспоненциального роста (лога­рифмическая). В это время митотическая активность наибольшая,

рост идет с ускорением, масса каллуса увеличивается. Третья фаза — линейная, характеризу­ется постоянной скоростью ро­ста каллусной массы. Четвертая — фаза замедленного роста, во вре­мя которой интенсивность деле­ния клеток резко снижается. Во время пятой фазы — стационар­ной — масса каллуса не увели­чивается, так как начавшееся от­мирание клеток еще компенси­руется за счет их деления. Далее следует отмирание каллуса.

Культивируемые каллусные клетки и ткани сохраняют мно­гие физиологические особенно­сти, свойственные клеткам рас­тения, из которого они были по­лучены. Сохраняются, например, такие свойства, как морозостойкость, устойчивость к абиотическим факторам (температура, засоление, фотопериодическая реакция), а главное, хотя и в разной степени, способность к синтезу вторичных метаболитов. Наряду с общими у каллусных клеток появляются свои, характерные только для них особенности. Например, длительно куль­тивируемые in vitro клетки высших растений, как каллусные, так и суспензионные, образуют специфическую популяцию, относящую­ся к типу неполовых, — популяцию соматических клеток. Наиболее характерные свойства этой популяции — физиологическая асин- хронность и генетическая гетерогенность.

Физиологическая асинхронностъ — наиболее важное свойство не-: половой популяции. Оно заключается в том, что в каждый дан-^! ный момент времени клетки находятся в разных фазах роста: однц делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Поэтому общее фи­зиологическое состояние такой популяции принято оценивать по состоянию большинства клеток. )

Причины возникающей асинхронности весьма разнообразны!?

жүктеу/скачать 5 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: