Высшее образование
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 5.10.1. Получение трансгенных растений
- Векторы на основе Ti-плазмид.
| I
Генно-инженерные методы, в частности технология рекомби-* нантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следова-, тельно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целе-' направленного изменения генотипа — трансформации — благси даря введению определенных генов. ' Проблемы выращивания сельскохозяйственных растений связаны с перспективой ввода в них генов устойчивости к стрессовым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам, генов скороспелости, а также с расширением круга культурных расте ний, способных к симбиотической фиксации азота и т.д. Генетическая трансформация заключается главным образом ^ переносе чужеродных или модифицированных генов в эукариоти- ческие клетки. Можно вводить гены в клетки прокариот, но этот перенос осуществляется не для трансформации, а в целях увеличения экспрессии чужеродных генов, их клонирования. В клетках растений также возможна экспрессия генов, перенесенных не только от других растений, но и от микроорганизмов и даже от животных. Получение растений с новыми свойствами из трансформированных клеток (регенерация) возможно благодаря их свойству то- типотентности, т.е. способности развиваться в целое растение. Однако возможности генной инженерии растений ограничиваются рядом причин. Во-первых, геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих. Это значит, что определение и выделение искомых генов — задача очень трудная. Во-вторых, не для всех растений удается подобрать условия регенерации. Стабильно получают растения-регенеранты из протопластов картофеля, люцерны, томатов, моркови, табака, капусты и др. Регенерацию злаков из их клеток пока не всегда удается воспроизвести. Наконец, одна из главных лимитирующих причин — размер гетерологичной ДНК (не более 35 кб для агробактериальной и немного больше для баллистической трансформации), которую можно было бы эффективно вводить в геном растения. Не так давно была сделана удачная попытка использовать при трансформации пыльцу в качестве супервектора, что позволяет исключить появление химерных растений (В. А. Аветисов, Ю. В.Давыдова и др., 1999). Имеются сообщения об использовании искусственной бактериальной хромосомы в качестве вектора для трансформации, которая позволяет переносить значительные фрагменты ДНК, вводить кассеты генов, кодирующие множественные ступени биохимических процессов. Это открывает такие огромные перспективы, что первостепенными становятся вопросы экологической безопасности. Биотехнология и, в частности, генная инженерия подошли к той ступени развития, когда прежде всего приходится думать о возможных последствиях эксперимента, об использовании полученных знаний. 5.10.1. Получение трансгенных растений Перенос генов в растительные клетки, так же как в клетки животных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуществляются главным образом благодаря специфическим структурам — векторам.
Векторы на основе Ti-плазмид. Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая образование опухолей — корончатых галлов. Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A. tumefaciens. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с большой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плаз-•> п.. мида (от ангд. tumor inducing— индуцирующие опухоль). Ti-плас миды — это естественные векторы для генов, обладающие всем* функциями, необходимыми для переноса, стабильного в ключе ния и экспрессии генетической информации в растениях. Ош_ имеют широкий круг хозяев. В бактериальных клетках Ti-плазми- ды реплицируются автономно. Эти плазмиды различаются по тигг кодируемых опинов — белков, которые используются бактериями в качестве источников азота и углерода. Обычно встречаются плазмиды, кодирующие два типа опинов: либо октопин (октопи новая плазмида), либо нопалин (нопалиновая плазмида). После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосома; клеток растения-хозяина. Следовательно, A. tumefaciens встраивает часть своего генома в ДНК растительной клетки и заставляет et- таким способом изменять метаболизм, синтезируя вещества, не обходимые для бактерий. Именно это свойство A. tumefaciens i послужило поводом для создания на основе Ti-плазмиды вектора, доставляющего необходимые гены в клетку. Участок Ti-плазмиды, встречающийся в хромосомах растительных клеток, называется Т-областью в бактерии и Т-ДНК в клетках растений. Т-область включает примерно 10 % Ti-плазмиды и содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опинов и подавление дифференцировки (гормоннезависимый рост клеток). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а рядом — в области вирулентности — vir-области (рис. 5.17). Т-области ограничены прямыми повторяющимися последовательностями, и любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за Т-область и перенесена в растительную клетку Недостаток этих плазмид состоит в том, что некоторые гены находящиеся в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений незави симо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой куль тивируются данные клетки. В свя зи с этим очень трудно регене рировать нормальное растение и клеток, содержащих полнук, последовательность Т-ДНК. Др> гой недостаток — большие par меры Ti-плазмиды, из-за коте рых затруднены какие-либо м. нипуляции с ней, поэтому вст вить ген в плазмиду традицио! ными методами невозможно. Т-область vir- область! Рис. 5.17. Взаимное расположение Т- и vir-областей в Ti-плазмиде В настоящее время констр ируются производные Ti-пла миды, в которых оставляют р гуляторный участок Т-обласг а вместо ее структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регенерации безвредны для растений. Существуют и другие бактерии (A. rhizogenes), вызывающие усиленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri- плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ri-плаз- миды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они служат естественными безвредными векторами, так как трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перспективные векторы. жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|